[实用新型]一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条

说明书

技术领域

本实用新型涉及一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，可以实现金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测诊断，适用于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测与应急处理，属于免疫检测技术领域。

背景技术

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种常见的食源性致病菌，虽然近年来不断有新型的金黄色葡萄球菌肠毒素（Staphylococcal enterotoxin，SE）被发现，但肠毒素SEA、SEB、SEC、SED、SEE引起的中毒占金黄色葡萄球菌食物中毒的95%，葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒以A型居多，D型次之。从生牛乳、生肉及乳酪中分离的金黄色葡萄球菌以产生D型肠毒素为主。

在食品加工过程中，经过热处理可以杀灭金黄色葡萄球菌，然而一旦菌体产生外分泌的肠毒素，那么存在于食物中的肠毒素非常稳定，100℃ 30min不被破坏，摄入人体后可以抵抗肠胃液中蛋白酶的分解，并引起人体的呕吐、腹泻等症状。2011年我国公布速冻面米制品新国标GB19295—2011，金黄色葡萄球菌由原来的不得检出变为限量检出，因此为了杜绝食品中金黄色葡萄球菌活菌数合格而肠毒素超标的情况，肠毒素的快速检测对于保障食品安全具有更加重要的意义。

近年来，ELISA凭借其灵敏、快速、特异性好、易于推广的特点越来越多地用于肠毒素的检测，但胶体金试纸条具有操作简单、稳定性高、不需要借助专门仪器、适合现场快速检测的优点，因此对于大量样品的现场检测、食物中毒的快速检测具有重要的意义。

实用新型内容

本实用新型目的在于提供一种检测金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，操作简单，快速方便，灵敏度高，稳定性好，成本低廉。

本实用新型适用于海关、企业、医院、检验检疫单位等，可实现食品或临床样本中金黄色葡萄球菌肠毒素D的快速检测。

本实用新型的技术方案，一种金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条，包括PVC底板，在PVC底板两端分别设有样品垫和吸水垫；

PVC底板中部设置有硝酸纤维素膜检测层，在硝酸纤维素膜检测层与样品垫之间设置有金标垫；所述金标垫一端与样品垫相连接叠放，另一端叠放于硝酸纤维素膜检测层上；

所述硝酸纤维素膜检测层上依次设置有检测线和质控线。

所述金标垫包被有金标标记的抗SED抗体5F2（CGMCC No.7212）。

所述检测线上包被有抗SED抗体10F1（CGMCC No.7213）。

所述质控线上包被有羊抗鼠IgG。

所述金黄色葡萄球菌肠毒素D的免疫胶体金快速检测试纸条的制备方法，金黄色葡萄球菌肠毒素D缩写为SED，步骤如下：

（1）抗SED特异性单克隆抗体的制备：

以北京军事医学科学院提供的重组表达的SED为免疫原，免疫 8周龄的BALB/c小鼠，经免疫、细胞融合、筛选，共筛选到10个单克隆抗体细胞株；

免疫程序如下：第一周进行首免，10μg/只，弗氏完全佐剂乳化后皮下多点注射；第四周进行二免，8μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第六周进行三免，6μg/只，弗氏不完全佐剂乳化后皮下多点注射；第七周尾部采血测效价，选择效价最高的小鼠；第八周进行冲刺免疫，4μg/只，生理盐水溶解，腹腔注射；冲刺免疫3天后眼眶采血后进行融合。筛选采用间接ELISA进行，共筛选到10个细胞株。

（2）特异性SED双抗体检测抗体的筛选：

将步骤（1）纯化后的10株单克隆抗体细胞株分别标记辣根过氧化物酶（HRP），直接法鉴定标记成功后进行双抗体夹心法配对，确定特异性免疫胶体金快速检测试纸条所需抗SED抗体；其中5F2为金标抗体，10F1为包被抗体；

（3）金黄色葡萄球菌肠毒素D免疫胶体金快速检测试纸条的制备：

a、空白胶体金的制备：

采用柠檬酸盐还原法制备胶体金颗粒，在锥形瓶中加入200mL去离子水和2mL质量浓度为1%的氯金酸，搅拌加热至沸腾，快速加入4mL 质量浓度为1%的柠檬酸钠，继续加热15~20分钟，至呈亮红色，然后室温中冷却，4℃冷藏保存；

b、胶体金标记抗体的制备：

空白胶体金溶液用0.1M 的K₂CO₃调节pH值至7.4，搅拌中滴加适量浓度步骤（2）制备的抗体，每毫升空白胶体金溶液加入30μg抗体5F2（CGMCC No.7212），继续搅拌30分钟，离心，吸取上清液，用金标抗体保存液重旋；