[发明专利]利用DNA纹身免疫制备抗体的方法

说明书

技术领域

本发明涉及抗体制备技术领域，具体涉及一种利用DNA纹身免疫制备抗体的方法。

背景技术

抗体指机体的免疫系统在抗原刺激下，由B淋巴细胞或记忆细胞增殖分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。主要分布在血清中，也分布于组织液及外分泌液中。1964年，世界卫生组织举行专门会议，将具有抗体活性以及与抗体相关的球蛋白统称为免疫球蛋白(Ig)，如骨髓瘤蛋白，巨球蛋白血症、冷球蛋白血症等患者血清中存在的异常免疫球蛋白以及正常人天然存在的免疫球蛋白亚单位等。

传统抗体生产方法中，免疫动物主要用两类免疫原物质，一是针对抗体靶点所设计的多肽分子；第二类是在大肠杆菌或真核细胞中表达的重组蛋白。而由此产生的抗体长期存在一些难以解决的问题。比如多肽免疫存在免疫原性差，且本身缺乏空间构像的缺点，因而产生的抗体往往亲和力低，不能与天然蛋白结合。而且免疫成功率低,一般小于50％。而在细菌中表达的重组蛋白不具有真核细胞蛋白固有的折叠，构象与修饰，因而产生的抗体往往也不理想。真核表达系统可以制造出具有天然构象的抗原蛋白，但由于表达量低且制作成本高，也不宜于大量使用。而且抗原蛋白与免疫佐剂混合过程中也会改变其性状与构象，降低抗原的免疫原性，导致抗体的滴度和特异性不高。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用DNA纹身免疫制备抗体的方法，采用DNA质粒免疫动物的方法取代传统的肽链及蛋白质免疫，解决传统抗体生产方法中存在的抗体滴度低，特异性差及不能识别天然抗原表位的缺陷。

为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

利用DNA纹身免疫制备抗体的方法，该方法包括

1)构建抗原蛋白表达载体的步骤：将目的基因的cDNA片断通过逆转录PCR扩增的方式从宿主细胞基因组中调出，然后克隆到表达载体中；

2)制备纯化的质粒DNA：利用大肠杆菌大量制备纯化的质粒DNA；

3)质粒DNA免疫：将质粒DNA纹身的方式注射入动物表皮内进行表达及免疫；

4)分离和纯化抗体：采用杂交瘤筛选单克隆抗体分离纯化或收集血清进行多克隆抗体提取纯化。

具体地，步骤1)中采用pcDNA3.1真核细胞表达载体，将目的基因插入到表达载体上的NheI/EcorI双酶切位点之间；构建好的载体经测序验证以确保目的基因序列的正确性以及序列已正确插入到载体上的蛋白表达阅读框内。

具体地，步骤2)具体为：将构建好的载体转入到DH5α大肠杆菌宿主细胞内进行扩增；扩增完成后提取和纯化质粒。

具体地，本发明采用Qiagen的无内毒素质粒提取试剂盒提取和纯化质粒。

具体地，所述步骤3)包括以下步骤：

S1：选择动物后腿侧面为纹身部位，对动物进行麻醉，待动物进入麻醉状态后，电动剃毛器去除需纹身部位及周边的毛发，并清理干净；

S2：将纯化好的DNA质粒涂抹于1cm²范围内的上述剔除毛发的部位，用针头对其进行纹身，完成纹身后用干净的棉拭子在纹身皮肤表面涂上止痛霜剂，并且每两周重复纹身免疫一次；

S3：免疫期间取血做ELISA及Western blot检测；

S4：待ELISA滴度达到1：8000以上且大于阴性对照3个标准差且Westernblot检测看到正确的阳性条带时进行脾细胞的融合或血清的收集和纯化；在融合或纯化血清前3天肌肉下注射纯化的DNA质粒一次进行强化免疫。

具体地，上述步骤5)中所述动物选自小鼠或新西兰白兔。

具体地，步骤4)中从血清中提取和纯化抗体的方法为盐析法、柱层析纯化、亲和层析纯化或离子交换层析中的一种或两种以上结合。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明的方法中，DNA质粒进入上皮细胞内后，细胞蛋白机器合成抗原蛋白质，且合成的蛋白不存在原核表达中的分子折叠，构像及糖基化修饰缺陷等问题；抗原蛋白可以长时间，持续地在上皮细胞内表达；

2.本发明的方法中，采用普通纹身器械将一定数量的DNA质粒通过上万次的穿刺注射入动物的皮内，并采用多次免疫的方式产生的抗原经过皮肤组织内丰富的抗原呈递细胞的处理与传递，激活T辅助性淋巴细胞进而活化B细胞分泌抗体的功能，从而产生亲和力与特异性具佳的高质量抗体；

3.通过本发明的方法免疫原刺激产生的抗体能够识别天然构象的蛋白，因而在临床诊断试剂和抗体药物研发方面具有重要的应用价值；