[发明专利]靶向T淋巴细胞的人源单链抗体

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程和蛋白质工程技术领域，具体地说，涉及编码包含人源CD3抗体可变区片段的DNA、其所编码的重组蛋白、该重组蛋白的生产方法、该重组蛋白的用途。

发明背景

T淋巴细胞是一种在人体内广泛分布的免疫效应细胞，在肿瘤免疫中发挥重要作用。T淋巴细胞发挥抗肿瘤效应的前提是其细胞内活化、增殖信号的启动。研究表明，CD3分子(cluster of differentiation 3)是T淋巴细胞活化的关键分子，其细胞内的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)可以提供T淋巴细胞活化所需的下游信号。目前，针对CD3分子的单克隆抗体可以有效诱导CD3细胞内的ITAM磷酸化，从而激活T淋巴细胞。因此，CD3抗体可以被用作一种提高肿瘤免疫的药物。比如，商品化的CD3抗体OKT-3，当采用低剂量时已经被用于激活T淋巴细胞，可以提高肿瘤免疫。

当前，单克隆抗体已经成为一类重要的生物技术药物，主要以gamma球蛋白为主，即IgG型抗体。IgG型抗体由2条重链和2条轻链通过二硫键构成，分子量约150kD。作为人体治疗用的单克隆抗体主要为IgG型嵌合抗体和采用CDR移植技术构建而成的人源化抗体。在这些抗体中，原来鼠源的抗体恒定区被替换为人源抗体恒定区，甚至鼠源抗体可变区中框架区的部分氨基酸也被替换为人源抗体基因的氨基酸。通过这些改造，在一定程度上减少了原来鼠源抗体疗法引起的HAMA(Human antimous antibody)效应，提高了临床治疗效果。尽管如此，由于抗体可变区的部分氨基酸仍然为鼠源序列，因此无法完全避免HAMA效应的发生。

从抗体药物应用来说，人源抗体是用于人体治疗最理想的抗体，可以有效减少抗-抗体的产生，这可以避免提高抗体药物的耐药。但是由于技术上的难度，目前世界上成功的人源抗体极少。首先，由于伦理限制，无法采用类似制备小鼠杂交瘤细胞的方法借助人体生产人源抗体。其次，目前世界上转人源抗体基因的工程小鼠极少，更为关键的是由于抗体多样性产生的过程需要重链V-D-J基因重排和轻链V-J基因重排，而人抗体基因重排过程在小鼠体内受到很大限制，因此导致抗体的多样性受限。另外，抗体库技术近年来也被用于筛选人源抗体，但是由于缺乏类似人体内生发中心中的抗体亲和力成熟过程，因此产生的抗体亲和力常常较低。然而，由于人源抗体独特的优势和巨大的治疗价值，目前已经成为抗体药物发展的重要方向。已经上市的阿达木单抗(adalimumab)就是通过抗体库技术产生的人源单克隆抗体，用于治疗自身免疫性疾病，已经获得了巨大成功。

近年来，基因工程抗体发展迅速，其中单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)就是一种重组小分子抗体。单链抗体由重链可变区和轻链可变区通过一条柔性连接肽构成，其大小仅为完整IgG型抗体的1/6，因而具有较好的组织渗透性。由于体积较小，单链抗体也经常与其他效应分子融合，作为重组蛋白药物的靶向识别域，因此单链抗体具有十分广阔的应用前景。尽管如此，由于缺乏抗体恒定区的支撑，因此并非所有单链抗体都能够保留有效的抗体结合活性，需要进行检验证实。而且，多数单链抗体的结合活性不足，往往需要进一步优化，因此获得具有足够结合活性的单链抗体是比较有挑战性的工作。

鉴于此，本发明提供了一种CD3单链抗体，特别的是，其重链和轻链可变区来源于人类抗体胚系基因，因此组成此CD3单链抗体的氨基酸为人源抗体序列。本发明的CD3人源单链抗体能够结合并靶向CD3阳性的T淋巴细胞。更重要的是，此抗体为全人源序列，可以有效地避免临床治疗应用中的HAMA发生。为本领域的具体提供了一种新的有效选择，具有很好的应用前景。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种抗人CD3的人源单链抗体，其能够结合CD3阳性的T淋巴细胞。

本发明首先提供了一种抗人CD3的抗体轻链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种抗人CD3的抗体重链可变区，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

上述的两段序列均为本发明首次获得的人源化序列。

在获得了上述人源化序列的基础上，本发明提供了一种抗人CD3的单链抗体，该单链抗体是是由上述的抗人CD3的抗体轻链可变区和抗人CD3的抗体重链可变区连接而成。