[发明专利]CYP4F2基因多态性的检测方法以及该方法的核酸探针和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种CYP4F2基因多态性的检测探针和扩增引物，属于生物技术领域。

背景技术

华法林是近几十年来广泛应用于心房颤动的血栓预防、卒中、静脉血栓栓塞症、机械瓣植入术后抗栓治疗等领域口服抗凝药物。该药为消旋异构体，其中R型对映体和S型对映体作用强度不同，S型的药理作用是R型的3-6倍。。该药物有很强的水溶性，经胃肠道迅速吸收，生物利用度近于100％。口服给药后90分钟达血药浓度峰值，半衰期36～42小时。在血液循环中与血浆蛋白结合(结合率98％～99％)。储积于肝脏的两种对映异构体通过不同途径代谢，大约90％S型华法林发生氧化代谢反应，主要被肝脏细胞色素P450系统的CYP2C9酶催化，少部分由CYP3A4催化。大约60％R型华法林发生氧化代谢反应，主要被肝脏细胞色素P450系统的CYP1A2和CYP3A4酶催化，少部分由CYP2C19催化。华法林的量效关系受遗传和环境因素(例如药物、饮食、各种疾病状态)影响，这些因素对其吸收、药物动力学及药效学产生影响。

受遗传因素的影响：华法林用药的剂量反应变异性大。

华法林在不同种族、年龄、性别人群的剂量不同。维生素K环氧化物还原酶主要受S型华法林抑制，而S型华法林的代谢主要由细胞色素P450(CYP2C9)催化。大量研究证明细胞色素P450(CYP2C9)和维生素K环氧化物还原酶复合体亚单位1(VKORC1)是两个重要基因，两个基因决定了华法林的代谢及抗凝效果。两个基因中主要有三个位点的多态性，基因多态性影响华法林的起始剂量和维持剂量。除此之外，CYP4F2基因多态性与华法林剂量也存在相关性。CYP4F2为维生素K的单氧酶，不同基因型的个体对维生素K代谢活性不同：野生型(CC基因型)代谢活性最高，而CYP4F2*3(突变纯合TT型)肝微粒体代谢活性最低，突变杂合子CT基因型介于两者之间，故CYP4F2*3突变会使酶活性下降，从而减少维生素K的代谢，使维生素K浓度升高，为达到相同的抗凝效果，需服用较高剂量的华法林。近年来，在白种人、黑种人及黄种人中进行的大多数研究均发现，CYP4F2*3基因突变会造成华法林剂量改变，其中T等位基因与华法林高剂量有关，并且TT型患者华法林剂量每日较CC型患者多1mg。近年来的研究还发现，在白种人中，CYP4F2*3的变异可以解释1％-7％华法林剂量个体差异。在中国人中，CYP4F2*3基因多态性可以解释4％华法林剂量。目前CYP4F2基因检测已经商品化，但国内医疗机构对华法林敏感基因检测只能使用西方的商业化产品。

中国医学科学院阜外心血管病医院在华法林用药剂量检测技术的研究方面具有丰富的临床数据和临床资源积累，同时这一研究也是“十二五”重大新药创制课题之一。将研究成果转化为供临床应用的检测试剂盒和对应的用药指南，能方便准确的确定临床用药剂量和指导医师用药，对提高心血管疾病的临床治疗效果将具有重大的价值。

现有技术中TaqMan探针法是一种高度特异的定量PCR技术，其技术原理的核心是利用Taq酶的5‘-3’外切核酸酶活性，切断探针，产生荧光信号。由于探针与模板是特异性结合，所以荧光信号的强弱就代表了模板的数量。

在TaqMan探针法的定量PCR反应体系中，包括一对PCR引物和一条探针。探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5‘端标记有报告基团(Reporter，R)，如FAM、VIC等，3’端标记有荧光淬灭基团(Quencher，Q)，如BHQ等。当探针完整的时候，报告基团所发射的荧光能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5‘-3’外切酶活性就会将探针切断，报告基团远离淬灭基团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。所以，每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程。信号的强度就代表了模板的DNA的拷贝数。

MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(NFQ)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度。同时探针上还连接有MGB(Minor Groove Binder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右，因为为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比普通的TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。因为在模板的DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的更容易设计。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能有效检测CYP4F2基因多态性的探针，并提供检测CYP4F2基因多态性的，以及用于该方法的试剂盒。