[发明专利]一种筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用蛋白质组学技术对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。

背景技术

咪唑立宾(Mizoribine,MZ,bredinin)咪唑立宾是日本旭化成从土壤霉菌的培养滤液中获得的咪唑类抗生素。作为免疫抑制剂，1991年12月起在日本临床肾移植中应用。日本许多临床移植中心已将咪唑立宾作为肾移植后的常规免疫抑制药物。我国近年也将其作为肾移植抗排斥药用于临床。咪唑立宾与同类药物硫唑嘌呤相比，肝毒性和骨髓抑制作用要小，它的主要不良反应是胃肠道反应、血液系统障碍和过敏症状，偶见骨髓功能抑制和急性肾功能衰竭。。目前，临床上针对个体病患，咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位一直无法确定，且常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低，难以在临床用药时提供具有药理意义和指导作用的检测结果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何克服现有技术的上述缺陷，提供一种利用蛋白质组学技术对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选的方法。

为解决上述技术问题，本筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法利用蛋白质组学技术，对咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位进行筛选，其具体方法包括以下步骤：

步骤1)：将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的咪唑立宾，整体形成咪唑立宾对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；

步骤2)：将步骤1)所述的咪唑立宾对免疫T细胞模型的药物作用样品组群培养至对数生长期；弃去培养液，刮取细胞收集细胞到若干对应的离心管；收集完成后用磷酸缓冲液冲洗细胞5次，经冲洗后吸干离心管内残留磷酸缓冲液，然后加入等体积10mol/L脲、50mmol/L DTT、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺1-丙磺酸、30mmol/L三羟甲基氨基甲烷形成的混合溶液，反复冻融细胞5～8次；放入冰盐浴中静置30min；然后升温至10℃的条件下离心2h；离心完成后取上清液测定蛋白浓度，并根据测得的蛋白质浓度标记、分装，转移至70℃的保温箱中储存存储备用；

步骤3)：将步骤2)中存储备用的上清液取出两组，每组各50ug，与等量10mol/L尿素、5％的3-[(3-胆酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸，20mmol/L二硫苏糖醇0.5％的IPG缓冲液组成的混合液体混合；混合后加入IPG持胶槽中，IPG干胶条的胶面向下放入槽中，并于其表面涂抹一层有机矿物油，IPG持胶槽加盖后置于IPGphor水平电泳仪电极板上进行等电聚焦；等电聚焦结束后，IPG干胶条在平衡液中平衡30min；平衡完成后将IPG干胶条移至SDS-PAGE分离胶上，并以琼脂糖封胶，将玻璃板置于电泳槽中以恒流方式进行电泳，至电泳槽中溴酚蓝前沿延伸至距凝胶底边5mm处停止电泳，得到凝胶；

步骤4)：将由步骤3)得到的凝胶染色，并用凝胶扫描仪透射扫描；将得到图像用PDQUEST软件进行分析，图像分析过程包括图谱的剪切，蛋白质点的检测，不同凝胶间的匹配，量的归一化以及利用内标2DMARKER的标准分了量和等电点确定胶内蛋白点的相对分子量和等电点；以正常条件下免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱为参考胶，与咪唑立宾作用下培养的免疫T细胞蛋白质的双向电泳图谱进行配比，获得咪唑立宾作用于免疫T细胞的差异表达蛋白质；

步骤5)：将由步骤4)得到的差异表达蛋白质经胶内酶切后，通过质谱，测定差异表达蛋白质；与质谱库比较，筛选出差异表达蛋白质；明确差异蛋白后，其生物学功能确定，通过蛋白印迹验证，即得咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位。

本发明筛选咪唑立宾于免疫T细胞中药物作用靶位的方法，操作思路明确、结果真实可靠，克服了常规筛选手段由于分析数据过于庞大和复杂，造成筛选结果误差较大，准确率低的缺陷，为临床用药提供了具有药理意义和指导作用的检测结果。

具体实施方式

本将培养至第五日的免疫T细胞，分为等量的对照组和若干试验组，向试验组中分别加入不同浓度的咪唑立宾，整体形成咪唑立宾对免疫T细胞模型的药物作用样品组群；