[发明专利]一种聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚合物接枝型疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法，属于高分子化学领域中的自由基聚合技术及生物化工领域中的蛋白质层析分离技术。

背景技术

随着杂交瘤技术、细胞生物学和基因工程等上游技术的进步，抗体及相关医用蛋白得到了迅速发展。抗体具有靶向性强、特异性高和毒副作用小的特点，广泛应用于肿瘤及自身免疫病等重大疾病治疗、体外诊断与检测，成为当前生物技术药物的重点发展方向。目前通过动物哺乳细胞培养，抗体表达量可以达到5g/L以上,但是抗体下游分离纯化过程成本较高，成为了抗体药物快速发展的瓶颈。

抗体产品纯度要求较高，还必须保持生物活性，分离纯化的难度较大。离子交换层析和疏水相互作用层析等技术虽然可以分离抗体，但是特异性和选择性较差，分离步骤多，影响抗体纯度和活性收率。基于蛋白A或蛋白G的亲和层析，是目前抗体分离的关键技术，选择性高、特异性强，但介质价格昂贵，吸附容量有限，且蛋白类亲和配基易被降解而脱落，重复使用次数有限，洗脱条件受限，因此操作成本较高。1998年，Burton和Harding(Burton and Harding,J.Chromatogr.A,1998,814:71)提出了疏水性电荷诱导层析(Hydrophobic charge-induction chromatorgraphy,HCIC)新方法，有效地结合了疏水、亲硫、氢键和静电等多种相互作用，在pH中性条件下，配基不带电荷，可以通过疏水等相互作用与目标蛋白结合，通过调节溶液pH,使配基带上电荷，通过静电排斥作用与目标蛋白解离，从而实现洗脱。HCIC具有对目标蛋白选择性高、洗脱条件温和、介质再生简单等优点，可以有效调控对目标蛋白的吸附与解吸，显示出良好的应用前景。专利(US Patent 5,652,348)描述了以巯基杂环化合物作为配基的HCIC介质及其制备方法。专利(US Patent 5,719,269；US Patent7,144,743)也报道了HCIC介质的制备工艺。中国专利(CN101279243；CN101279244；CN101284224)报道了在HCIC介质空间臂中引入砜基来提高介质对抗体的选择性及相关制备方法。中国专利(CN104096544；CN104117345)报道了以氨基苯并咪唑为配基以及色氨酸和氨基苯并咪唑为双功能基团的疏水性电荷诱导HCIC介质。这些HCIC介质主要以疏水相互作用与抗体结合，配基密度不高，且配基仅分布于基质孔道的表面，吸附性能有限，层析分离过程的操作流速较低。因此，开发聚合物接枝型HCIC新型介质，提高动态载量、操作流速和过程处理量，对于抗体的规模化分离有着重要的意义。

原子转移自由基聚合技术(ATRP)形成于20世纪90年代(J.Am.Chem.Soc.1995,117:5614；Chem.Rev.2001,101:2921)，是一种活性可控自由基聚合方法，利用电子转移再生活化剂的原子转移自由基聚合反应(ARGET-ATRP)是最近开发的一种新技术(Langmuir.2007,23:4528)，可提高催化剂活性，降低催化剂及配体使用量，并可在少量氧气的环境下反应。因此，本发明针对HCIC介质的特殊要求，采用ARGET-ATRP新方法，在多孔微球基质的内部孔道形成聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝，并将HCIC偶联到聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝上，制备聚合物接枝的HCIC新型介质，提高配基的偶联效率和密度，改善配基在基质内的空间排布，提高抗体的吸附容量和吸附速率，有利于层析介质在高流速下实现抗体的高效吸附，相关内容国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质及其制备方法。

以聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝的疏水性电荷诱导层析介质包括层析基质、聚合物接枝链和配基，所述的层析基质为带有羟基的亲水性多孔微球，聚合物接枝链为聚甲基丙烯酸缩水甘油酯，配基为2-巯基-1-甲基咪唑。

层析介质的结构组成为：

所述的层析基质为具有多孔结构和表面羟基的亲水性多孔微球。所述的层析基质为琼脂糖凝胶或纤维素微球。

所述的层析基质表面羟基经活化和聚合反应形成的聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝。

所述的配基为经2-溴异丁酰溴活化和聚甲基丙烯酸缩水甘油酯接枝后偶联的2-巯基-1-甲基咪唑。

所述的层析介质的配基密度为70-1000μmol/g介质。