[发明专利]一种提取高硫低浓度菌液RNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA的提取方法，特别涉及一种基于Plus RNA Purification Kit的提取高硫低浓度菌液RNA的方法。

背景技术

核糖核酸(缩写为RNA，即Ribonucleic Acid)，是一种存在于生物细胞以及部分病毒、类病毒中的遗传信息载体。

当细菌数量不足时，此时针对低浓度菌液的传统的酶活测定方法的检出限和灵敏度均不能满足要求。而酶的活性一定程度上受到转录水平的控制和影响。换句话说，酶的基因转录水平一定程度上可以代表酶的表达活性。因此，可以用转录水平来表征关键酶的表达情况。而酶的转录水平的测定主要采用反转录PCR(Reverse Transcription PCR，RT PCR)和qPCR相结合的方法，主要步骤为：提取菌群RNA→RT PCR→qPCR。其中RNA提取是一个关键和前提步骤，提取的RNA的浓度和纯度直接影响到后续实验的进行和实验结果的准确性。

目前广泛采用的RNA提取方法为TRIzol法，传统的提取方法均针对细胞数量较大的样品，如人体的组织细胞、植被的组织细胞等等。Invitrogen公司发明的Plus RNA Purification Kit对于提取小剂量的RNA具有较好的效果。其中第一步骤提出首先将菌液加入到1mLTRIzol溶液中，冰上放置10min。

前期实验发现，将菌液加入到1mLTRIzol溶液中放置时TRizol溶液发生了沉淀现象，不能有效的起到破坏细胞和保护RNA不被降解的作用。在此基础上，加大了TRIzol溶液的使用量并延长了反应时间，沉淀现象有所缓解。因此需要找到一种快速破坏细胞并且保持TRIzol溶液有效成分的针对高硫低浓度菌液RNA提取的方法。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种针对高硫低浓度菌液RNA提取的方法。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种提取高硫低浓度菌液RNA的方法，包括以下步骤：

(1)制作细胞破碎管；

(2)用灭菌后的0.22μm滤膜将高硫低浓度菌液进行过滤去除部分硫化物并富集菌群；

(3)将步骤(2)得到的滤膜放入细胞破碎管中，加入TRIzol溶液提取RNA；

(4)用RNA Purification Kit对提取到的RNA进行纯化，并用NanoDrop2000超微量分光光度计测定RNA的含量和纯度。

步骤(1)中所述的细胞破碎管内放有直径不同的玻璃珠并灭菌，玻璃珠直径在0.1mm～5mm之间。

采用本发明的方法，能快速破坏细胞并且保持TRIzol溶液有效成分。解决了将菌液加入到1mLTRIzol溶液中放置时TRizol溶液发生沉淀现象的问题。

具体实施方式

以下是采用本发明的方法提取高硫低浓度菌液RNA的一个实例。

提取以硫化物为电子供体的从海水中驯化得到非光合固碳微生物菌群。电子供体为：0.46％NaNO₂，0.50％Na₂S₂O₃，1.25％Na₂S的混合物。

其中：1：使用Plus RNA Purification Kit自带提取方法提取RNA(TRIzol使用量1mL)。

2：增加TRIzol用量(1.8mL)，除此外根据Plus RNA Purification Kit自带提取方法提取RNA。

3：采用本发明的方法提取RNA。

C：提取RNA的浓度

OD₂₆₀：核酸的吸收峰

OD₂₈₀：蛋白质的吸收峰

OD₂₆₀/OD₂₈₀：1.8～2.0时，认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的；<1.8时，溶液中蛋白或者其他有机物的污染比较明显；>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。纯RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值为2.0。

实验证明，采用本发明的方法，RNA的提取效率是原有方法(方法1)的2.7倍，是通过增加TRIzol使用量这种方法(方法2)的1.7倍。另外，本发明的方法提取的RNA的纯度并未下降，OD₂₆₀/OD₂₈₀满足后续实验的要求。