[发明专利]一种RP-IP-HPLC法收集依诺肝素寡糖的方法

说明书

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种RP-IP-HPLC法收集依诺肝素寡糖的方法。

背景技术

依诺肝素(Enoxaparin)属于低分子肝素的一种，由肝素苄酯经过碱性β-消除反应而来，是一种由许多链长不一的肝素小分子组成的混合物，结构非常复杂。目前依诺肝素在临床上主要用于预防深静脉血栓形成及肺栓塞、治疗已形成的静脉血栓、预防血液透析时体外循环中血栓的形成以及治疗不稳定性心绞痛和非Q波心梗等。

作为一种由粘多糖聚合物组成的复杂混合物，依诺肝素含有许许多多的寡糖链。大部分的寡糖链在其非还原端含有4,5不饱和糖醛酸结构，有15％-25％的寡糖链在其还原端含有1,6酐环的结构，由此决定了依诺肝素具有链长的多分散性、双糖单元及其在寡糖链中分布顺序的多样性、寡糖链中末端修饰的双糖单元多样性等特点。

鉴于依诺肝素结构的高度复杂性，要改进依诺肝素的生产工艺就必须在其分子细节结构上进行定向修饰和分析鉴定，而在进行依诺肝素的寡糖结构分析前就必须收集数量足够多且纯度高的寡糖成分。

目前对于依诺肝素中寡糖的常规收集方法主要包括有酶降解-HPLC收集法和超滤收集法。其中酶降解-HPLC法主要将多糖降解成寡糖后再使用HPLC进行收集，一般只能收集到单糖、双糖和三糖等短链寡糖，收率较低且纯度不高，并需要经过多次分离才能获得，同时由于该方法对依诺肝素的寡糖链进行了切割，使得寡糖的序列受到了破坏；超滤法只能截留一定分子量范围的物质，是一种比较粗放的方法，虽然可结合使用HPLC进行精制，但收集流程比较长，效率低同时纯度也不高，不适用一般的分析实验使用。

本发明提出一种采用凝胶渗透色谱法及高效液相色谱连接质谱技术，从依诺肝素中分离收集完整的四糖子组分并进行确认的方法，这种方法对依诺肝素钠的各寡糖特别是短链的寡糖分离效果良好，不仅能分出四糖、六糖等含量高的偶数寡糖，对于含量较低的奇数寡糖也能分离，例如四糖后面的三糖、四糖和六糖之间的五糖，并可进一步应用在达肝素、那曲肝素等其他低分子肝素的寡糖收集和鉴定工作。本方法严谨、科学，具有极高的实际使用价值和长远深刻的社会意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种收集、检测依诺肝素寡糖的方法。

本发明的方法是通过采用GPC和RP-IP-HPLC联合分离法收集依诺肝素钠中的寡糖总组分及其子组分，并通过电喷雾质谱(ESI-MS)对所收集的寡糖子组分结构进行解析确认。

本发明所述的寡糖包括但不限于，三糖、四糖、五糖、六糖。

本发明以收集四糖组分为例，所述收集方法包括以下步骤：

a、从依诺肝素中收集出总四糖组分(即四糖组分的混合物)：取浓度为50～70mg/ml的依诺肝素钠溶液用高分辨的凝胶渗透色谱法(GPC)分离，得到总四糖组分。

b、采用RP-IP-HPLC从总四糖组分中收集出单四糖组分：取总四糖组分配制成浓度为10mg/ml水溶液用反向离子对液相色谱(RP-IP-HPLC)进行预分离，取预分离的四糖子组份分别制成1mg/ml的水溶液再用反向离子对液相色谱(RP-IP-HPLC)进行分离提纯。

c、将所收集的单四糖组分配制成1mg/ml水溶液通过ESI-MS进行结构解析。

其中，步骤a中所述的凝胶渗透色谱法，其色谱条件如下表1：

表1