[发明专利]一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及软骨细胞培养领域，尤其涉及一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法。

背景技术

关节软骨主要是由软骨细胞和细胞外基质组成的无血管组织，主要依靠关节的运动和挤压吸收营养物质，所以软骨损伤后自我修复能力比较弱，其损伤后的修复移植一直以来是医学界的难题之一。近年来，随着组织工程技术的发展，自体软骨移植在软骨损伤的临床治疗在国内外都有应用。临床研究对患者组织取材有限，并且也因为软骨细胞是终末分化细胞，体外增殖能力有限且易去分化，所以对体外软骨细胞的培养和扩增成为目前要解决的关键。

为了对体外软骨细胞进行培养和扩增，出现了多种培养软骨细胞的软骨细胞培养基。例如，现有技术提供的一种传统软骨细胞培养基的配方为：培养基+10％自体血清+60μg/ml Vc。

但是，发明人发现，利用该软骨细胞培养基在培养软骨细胞的过程中，软骨细胞去分化趋势严重，软骨细胞的增殖能力差，极大的限制了软骨细胞的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于，提供一种软骨细胞培养基及软骨细胞培养方法，能够降低软骨细胞的去分化，提高软骨细胞的增殖能力。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

第一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养基，包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1-15 ng/ml的骨形成蛋白BMP-2或者其类似物。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为5-100ng/ml的碱性成纤维生长因子bFGF和浓度为3-30ng/ml的转化生长因子TGF-β。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为20-200μg/ml的维生素C。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为2-20μg/ml的胰岛素和浓度为1-20ng/ml的胰岛素生长因子IGF-1。

优选的，所述血清为胎牛血清或者自体血清。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为(0.5-5)*10-6M/L的地塞米松。

优选的，所述软骨细胞培养基还包括浓度为1％的丙酮酸钠和2-20ng/ml的白细胞介素(IL-1)。

优选的，所述基础培养基为DMEM或者DF12。

另一方面，本发明实施例提供一种软骨细胞培养方法，通过使用第一方面所述的软骨细胞培养基，培养预先制备的原代人软骨细胞，获取传代3-5次的软骨细胞。

优选的，软骨细胞的培养方法还包括：制备原代人软骨细胞，具体为：

将人关节软骨组织用0.05-1％II型胶原酶消化；

将完成消化的细胞用培养液稀释后，离心收集细胞；

用培养液离心洗涤，获取原代人软骨细胞。

本发明实施例提供的一种软骨细胞培养基包括：基础培养基、浓度为5-20％的血清、浓度为1-20ng/ml的血小板源性生长因子和浓度为(1-5)*10-5M/Lβ-巯基乙醇。该软骨细胞培养基用于培养软骨细胞，能够改善软骨细胞的培养状态，降低软骨细胞去分化趋势，提高软骨细胞的增殖能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1-a为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代一次的光学显微照片；

图1-b为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代两次的光学显微照片；

图1-c为使用相应的A-G培养基培养的软骨细胞传代三次的光学显微照片；

图2为对软骨细胞培养基A-G培养的第三代细胞进行甲苯胺蓝染色的光学显微照片；

图3为对软骨细胞培养基A-G培养的第三代细胞进行Ⅱ型胶原免疫组化分析的光学显微照片。

具体实施方式