[发明专利]一种检测水体重金属铅的微生物学方法

说明书

本发明提供一种检测重金属铅的大肠杆菌工程菌株的构建方法及其检测水体中铅方法的建立。本发明所述基因工程菌株为PpbrA‑pbrR‑PpbrA：：DsRed‑express2/E.coliΔzntRΔzntA，命名为E.coli WMC‑008p CGMCC No.9748，其中zntA和zntR基因发生缺失突变失活，来源于耐金属贪铜菌CH34株的pbr操纵子敲入表达红色荧光蛋白DsRed‑express2。本发明所述工程菌株相比含报告质粒的大肠杆菌报告菌株具备操作简便、荧光本底值低、信号稳定等优势。本发明所述工程菌株能够反映水体中铅的生物有效性，将为客观评价水体中铅的生物毒性效应提供依据。

技术领域

本发明涉及一种检测重金属铅的微生物学方法，具体涉及利用基因工程技术改造的大肠埃希氏菌的构建方法及其检测水体环境中铅方法的建立。

背景技术

随着工农业的发展，很多含有铅离子的污染物排放入江河湖泊中，污染土壤、水源甚至是日常食用的粮食蔬菜。环境中的铅主要来源于各种油漆、涂料、蓄电池、冶炼、五金、机械、电镀、化妆品、染发剂、釉彩碗碟、餐具、燃煤、膨化食品、自来水管等。研究发现过量的重金属铅对于所有的生命体都是有毒的，人体吸收过量的铅后，可蓄积于人体重要器官肝、肾、脑等。它是通过皮肤、消化道、呼吸道进入体内与多种器官亲和，主要毒性效应是贫血症、神经机能失调和肾损伤，易受害的人群有儿童、老人、免疫低下人群。铅对水生生物的安全浓度为0.16mg/L，用含铅0.1～4.4mg/L的水灌溉水稻和小麦时，作物中铅含量明显增加。人体内正常的铅含量应该在0.1mg/L，如果含量超标，容易引起贫血，损害神经系统。而幼儿大脑受铅的损害要比成人敏感得多，一旦血铅含量超标，应该采取积极的排铅毒措施。儿童可服用排铅口服液或借助其他产品进行排铅。

目前监测和检测重金属污染物主要有两种方法：(1)物理化学分析法，如电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)等，其优点是具备高检测灵敏度和高特异性，但也存在一些不足，如仪器设备昂贵，操作复杂，检测周期长，最重要的一点是，传统的物理化学方法主要是对环境重金属总量进行测定，不能检测重金属的生物可利用度；(2)微生物法，其优势是成本低廉、操作简易，可以直接反映污染物对生物有机体的毒性及影响。除此，该方法常用的模式生物(如大肠埃希菌)繁殖及生存能力强，易储存和稳定性高，以其为生物学感应元件的微生物细胞传感器可以极大简化传感器的制作过程，提高传感器的检测效率。

但是，目前关于铅在大肠埃希菌的具体耐受机制仍未见报道。然而根据Rensing C等在文献Pb(II)-translocating P-type ATPases.J Biol Chem.1998Dec 4；273(49)：32614-7，已发现大肠埃希菌中负责编码将铅离子泵出的P-Type ATPase基因zntA及其调节蛋白基因zntR；但是zntA基因的启动子对铅并非完全特异，它还能被锌、镉等离子非特异性启动，故其启动子不能作为铅检测的特异性元件。据Hobman JL，Julian DJ等在Cysteinecoordination of Pb(II)is involved in the PbrR-dependent activation of thelead-resistance promoter，PpbrA，from Cupriavidus metallidurans CH34.BMCMicrobiol.2012Jun 18；12：109和Wei Wei等在文献Simple Whole-Cell Biodetectionand Bioremediation of Heavy Metals Based on an Engineered Lead-SpecificOperon.Environ Sci Technol.2014Mar 18；48(6)：3363-71报道，贪铜菌属中PbrR的启动子能被铅离子特异性启动表达下游基因，其对铅离子的特异性已得到证实。