[发明专利]一种埃博拉病毒一步法核酸定量RT-PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，涉及一种生物检测技术，尤其涉及一种用于埃博拉病毒核酸的荧光定量检测的试剂盒。

背景技术

埃博拉病毒（Ebolavirus,EBV）属于丝状病毒科（Filoviridae），是一种能引起人类和灵长类动物产生埃博拉出血热（Ebolahemorrhagicfever,EBHF）的烈性传染病病毒，病毒潜伏期可达2至21天，但通常只有5天至10天；罹患此病可致人于死，包含数种不同程度的症状（包括恶心、呕吐、腹泻、肤色改变、全身酸痛、体内出血、体外出血、发烧等），感染者症状与同为纤维病毒科的马尔堡病毒（Marburgvirus）极为相似，具有50%至90%的致死率，致死原因主要为中风、心肌梗塞、低血容量性休克或器官衰竭。EBHF在几个世纪前即流行于中非热带雨林地区和东南非洲热带大草原，目前在非洲大陆的许多国家均报道了本病。EBHF疫源地主要在非洲大陆，美国、泰国、英国、加拿大等国也有本病流行的血清学证据。迄今为止，EBV已发现有5个亚种，分别为：

Zaireebolavirus（EBOV）(扎伊尔埃博拉病毒，1976）-标准亚种

Sudanebolavirus（SUDV）(苏丹埃博拉病毒，1998）

Restonebolavirus（RESTV）(雷斯顿埃博拉病毒，2002）

Ta?Forestebolavirus（TAFV）(科特迪瓦埃博拉病毒，2010）

Bundibugyoebolavirus（BDBV）(邦地布优埃博拉病毒，2012）

每个EBV病原体是由链状的负链核糖核酸（RNA）病毒粒子构成。3'-端没有多聚腺苷酸化，5'-端也没有加帽（capping）。基因组编码七个结构蛋白和一个非结构蛋白。

EBV基因顺序是：3'-端-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5'-端，两端的非编码区含有重要的信号以调节病毒的转录、复制和新病毒颗粒的包装。如果缺少相应的蛋白，单基因组本身并不具备感染性，其中一种蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，是病毒基因组转录成信使RNA所必须的酶，它对病毒基因组的复制也有重要作用。其所编译的蛋白中，NP是核衣壳蛋白，VP30和VP35是病毒结构蛋白，VP35具有抗I型干扰素作用，GP是跨膜糖蛋白，与病毒的入侵过程及细胞毒性有关，VP24和VP40与病毒的成熟释放有关，前者是小型膜蛋白，后者是病毒基质蛋白。

EBV是人畜共患病毒，主要的感染途径是透过患者体液传染，如血液、汗、呕吐物、排泄物、尿液、唾液或精液等，目前并无飞沫感染的证据。尽管世界卫生组织苦心研究，至今仍没有辨认出任何有能力在爆发时存活的动物宿主，目前认为果蝠是病毒可能的原宿主。因为埃博拉的致命性，加上目前尚未有任何疫苗被证实有效，EBV被列为生物性危害第四级病毒（艾滋病为3级，SARS为3级，级数越大防护越严格），也同时被视为是生物恐怖主义的工具之一。

目前，对EBV的临床诊断方法，可用免疫荧光方法（IFA）检测培养细胞中的病毒抗原，用乳鼠脑内接种分离和鉴定病毒等。血清学诊断方法还有空斑减少中和试验（PRNT）等。应用组织学、免疫细胞化学及超微结构检查等方法研究发现，感染EBV后猴皮脂腺周围血管结构抗原阳性，提示可用病人含汗腺皮肤作为实验诊断材料。酶联免疫吸附试验（ELISA）是确诊疑似病例的首选方法，其次可选用逆转录套式-聚合酶链式反应（RT-PCR）。福尔马林保存的死者皮肤用免疫组化试验（IHC）检测抗原，可用于诊断和监测，此法不需冷藏保存标本，操作安全。这些方法均可在不具备P4级安全防护条件下进行。特异性IgM和IgG抗体约在患病初期（8～10d）出现，故对发病初期的可疑病例检查抗原和分离病毒更可靠，因为这种急性高病死率的疾病在病死前有的还查不到抗体。

EBV是高度危险的病原体，必须在P4级的高度安全实验室内进行病毒的分离与鉴定。在非洲疫区主要通过检测埃博拉病毒的特异性IgM和IgG抗体以及检查病毒抗原或核酸等进行诊断。

由于对于EBV的病理不详，所以无有效治疗手段。目前对EBHF无特效治疗药物，主要为对症治疗，重症病例需给予支持性护理，因病人常脱水，需静脉输液，可考虑使用大剂量干扰素及抗血清。抗EBV免疫血清球蛋白G对志愿者使用证明安全有效。使用免疫血清中止治疗后对动物无长期保护作用。

2014年8月9日，中国宣布已掌握埃博拉病毒抗体基因，同时具备对埃博拉病毒进行及时检测的诊断试剂研发能力。