[发明专利]一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用

说明书

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用。

背景技术

硝基还原酶家族属黄素酶，通常含有黄素单核苷酸单元或黄素腺嘌呤二核苷酸单元，可以在辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸存在下代谢芳香族硝基化合物或者硝基取代的杂环化合物，根据对氧气是否敏感以及电子转移方式不同硝基还原酶可分为两类：一类是氧气不敏感型，这类硝基还原酶通过双电子转移方式在氧气存在或缺氧条件下通过NADPH的作用均可将硝基化合物还原为亚硝基和羟胺中间体以及最终的氨基化合物；另一类是氧气敏感型，这一类硝基还原酶只有在厌氧条件下才能还原硝基化合物，这是因为在氧气存在下通过单电子还原硝基化合物得到的硝基阴离子自由基会直接与氧气发生反应生成超氧自由基，重新生成最开始的硝基化合物。

硝基还原酶通常存在于细菌如大肠杆菌中。研究表明缺氧组织或细胞以及肿瘤中硝基还原酶的含量相对正常状态呈现升高趋势。在缺氧条件下以还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH作为电子供体细胞内的硝基还原酶可催化多种外源硝基芳香族化合物发生单电子转移，生成硝基阴离子自由基，随后进一步被还原成羟胺或氨基。因此，硝基还原酶可以作为衡量细胞或生物体缺氧状态的重要指标。另一方面，硝基还原酶在药物的激活和硝基芳香族化合物的生物降解中也起着重要作用，并在生物技术肿瘤治疗抑制剂领域拥有良好的应用前景。因此，测定生物体系中的硝基还原酶对进一步了解其生物功能非常重要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种硝基还原酶的特异性荧光探针及其应用，该底物原型和水解产物的荧光属性具有明显差异，且产物更易检测。利用该探针反应可对多种生物体系中硝基还原酶的分布和功能进行定量评价。

本发明提供了一种硝基还原酶的特异性荧光探针，该底物的硝基可以被硝基还原酶代谢为相应的氨基化合物，产物显示与底物不同的发射波谱；该底物是以苊醌为原料，通过硝化反应得到的，其结构通式如(1)所示。

本发明提供了硝基还原酶的特异性荧光探针的应用，该底物作为硝基还原酶的特异性底物，发生还原反应，通过定量检测单位时间内还原产物的生成量来测定酶或细胞制备液等生物样品及细胞中硝基还原酶的活性。具体测定方法为：

——体系中以5-硝基苊醌作为特异性探针底物；底物浓度选择1/10～10K_m；单点测定时底物浓度优选K_m。

——在PBS或Tris-HCl等常用缓冲液中，反应温度为20℃至60℃之间，优选37℃为最优反应时间；孵育体系pH介于5.5～10.5之间，优选pH 7.4为最优反应pH值；

——反应时间为5～120分钟，在确保以上底物相应的水解产物达到定量限且底物转化率不超过20％时终止反应；

——测定单位时间内水解产物生成量作为硝基还原酶活性的评价指标。

本发明提供的硝基还原酶特异性荧光探针底物的应用，所述底物消除率或水解产物的生成率应介于0.1％～20％之间。

本发明提供的硝基还原酶特异性荧光探针底物的应用，探针底物及其水解产物均具有荧光属性，可采用荧光检测器实现产物及底物的快速灵敏检测；荧光检测条件为：激发波长430nm，在460～660nm进行荧光发射谱的检测。此外，该特异性探针底物及相应硝基还原酶活性检测过程不会受生物体系基质及杂质的干扰，可用于各种生物体系中硝基还原酶活性的定量测定。

该特异性探针反应可用于重组羧酸酯酶、人及动物组织制备液及各类组织细胞中硝基还原酶活性的定量测定，还可用于快速筛选硝基还原酶的抑制剂及抑制能力的定量评价。

作为高特异性的硝基还原酶的荧光探针底物，该化合物可以用来检测硝基还原酶的活性，尤其适合用于对细菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞以及酵母菌克隆表达体系产生的硝基还原酶重组酶的酶活性测定，以及多种哺乳动物组织器官来源的组织微粒体、S-9等制备物中硝基还原酶的活性标定。

本发明提供了一种5-硝基苊醌作为硝基还原酶荧光探针底物的应用，其经硝基还原酶代谢后可生成具有双光子荧光属性的代谢产物。该酶促反应具有选择性高、代谢产物易检测、酶活性及抑制活性评价快速高效等特点。

选用本发明所述硝基还原酶的特异性探针底物检测硝基还原酶体外活性具有以下突出优势：

(1)高特异性：5-硝基苊醌可被硝基还原酶高特异性地代谢成一个代谢产物，即硝基还原成氨基的产物。

(2)廉价易得：5-硝基苊醌及其代谢产物均可经化学合成获得，合成工艺简单易行。