[发明专利]一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种DNA四面体纳米结构信号探针及其应用。

背景技术

DNA电化学生物传感器以其快速、灵敏、低成本及易微型化等优点在临床医药、食品检验、环境检测以及反恐等各个领域有着巨大的潜在用途。决定DNA电化学生物传感器性能的一个重要方面就是信号放大体系。

由于DNA作为生物标志物在疾病诊断中具有非常重要的地位。因此用于检测临床样本中低浓度的DNA的生物标志物的超灵敏DNA传感器至关重要。其中，电化学DNA传感器是有前途的一个，因为其响应速度快，使用方便，成本低，可以直接进行DNA检测。电化学DNA传感器于2003年被首次发明，其中“三明治”式的电化学DNA传感器得到了广泛的应用。一个典型的“三明治”式的电化学DNA传感器由固定到电极上的单链DNA捕获探针识别层的和一个单链DNA信号探针将目标DNA固定在电极表面，并通过各种方式转化为电化学信号。捕获探针和信号探头与目标DNA形成夹心结构，看起来像一个“三明治”。

要想使得“三明治”式的电化学DNA传感器提高灵敏度，两个关键部分是“识别层”与“信号转导”。“识别层”最常用于电化学DNA传感器的捕获探针是巯基修饰的单链DNA，通过金-硫键实现捕获探针在电极上的固定。但这种方法存在一定的缺陷，因为单链DNA是一种柔性的分子，并且探针DNA的碱基与金之间有吸附位点，单链DNA容易平躺在金表面上。科学家们尝试了多种方法来改善这种情况。例如，添加一些小分子稀释剂，这样小分子可以取代探针碱基与金之间的相互作用，使探针DNA一定程度直立在电极表面。最近，DNA四面体纳米结构捕获探针吸引了极大的兴趣。三维的DNA四面体纳米结构最早在2004年开发，然后首次在2010年用于电化学DNA传感器。根据报道，DNA四面体可以固定在金电极表面，通过修改其三个顶点与硫醇基团，而第四顶点可以被设计成具有为互补的靶DNA或miRNA的一部分的延伸的DNA捕获探针。由于其刚性结构的优点，该DNA四面体纳米结构可保证该DNA捕获探针具有良好控制的密度和取向。“信号转导”是提高电化学检测性能又一个非常重要的因素。大量的信号分子如氧化还原酶，纳米颗粒标记已经被用来放大信号。辣根过氧化物酶(HRP)具有稳定，高效，可商购的，容易与DNA 探针上的生物素共价结合等优点。因此被广泛应用于电化学生物传感器的信号转导。

通常，用于结合HRP的信号探针是生物素修饰的单链DNA。然而，由于一条单链DNA信号探针通常只能结合一个HRP酶，从而导致酶反应的效率不高。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的第一方面提供一种DNA四面体纳米结构信号探针，所述信号探针为由一条5’端延伸出来一段DNA识别序列的单链DNA和三条5'端修饰了标记分子的单链DNA自组装形成的一个具有四面体底座的DNA信号探针，所述四面体的一个顶点上延伸所述DNA识别序列，所述的DNA识别序列与待测目标DNA或miRNA互补结合，其他三个顶点含有标记分子。

优选的，所述标记分子为生物素分子。所述标记分子能特异性地与带修饰的信号分子结合，实现多信号放大。所述带修饰的信号分子为带修饰的氧化还原酶；更优选的，所述带修饰的氧化还原酶为亲和素修饰的氧化还原酶，通过生物素和亲和素的结合作用连接和氧化还原酶分子，进而通过DNA碱基互补产生信号。

优选的，所述氧化还原酶选自辣根过氧化酶或葡萄糖氧化酶；更优选辣根过氧化酶。

优选的，所述四面体的边长可以通过调整DNA碱基配对数来改变其长度。更优选的，所述四面体的边长是由17对碱基互补配对形成。

优选的，构成所述DNA四面体纳米结构信号探针的四条单链DNA的序列，如SEQ ID NO.1～4所示：

Tetra-a-reporter：

5'-AAAAAAAAAAACATTCCTAAGTCTGAAACATTACAGCTTGCTACACGAGAAGAGCCGCCATAGTA-3'。(SEQ ID NO.1)

优选的，Tetra-a-reporter的5'端延伸一段DNA识别序列。

Tetra-b：

5'-TATCACCAGGCAGTTGACAGTGTAGCAAGCTGTAATAGATGCGAGGGTCCAATAC-3'。(SEQ ID NO.2)

Tetra-c：