[发明专利]猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX及其应用

权利要求书

1.猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒，其特征在于，其为RvHBJX，是以低致病性PRRSV病毒毒株HB-1/3.9为骨架，高致病性PRRSV毒株JXwn06结构蛋白编码区直接替换低致病性PRRSV病毒毒株HB-1/3.9结构蛋白后得到的嵌合病毒；

所述高致病性PRRSV毒株结构蛋白编码区的基因序列如SEQ ID NO.1所示。

2.猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒，其特征在于，通过以下方法构建得到：

(1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩增产物命名为HJSP-S2；

(2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧序列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；

(3)将步骤(1)和(2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；

(4)HJSP-S123纯化后经Rsr II、Asc I双酶切，连接到相同双酶切的pWSK-HB-1/3.9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP；

其中，步骤(1)PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示；

其中，步骤(2)PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示；

其中，步骤(3)PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ IDNO.8-9所示。

3.制备权利要求1所述的猪繁殖与呼吸综合征病毒嵌合病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒RvHBJX全长cDNA克隆质粒；

(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(1)的克隆质粒通过以下方法构建得到：

1)以pWSK-JXwn为模板，PCR扩增得到JXwn06的整个结构蛋白编码区，扩增产物命名为HJSP-S2；

2)以pWSK-HB-1/3.9为模板，分别PCR扩增HB-1/3.9结构蛋白编码区两侧序列，分别命名为HJSP-S1、HJSP-S3；

3)将步骤1)和2)的扩增产物纯化回收后，以HJSP-S1，HJSP-S2，HJSP-S3 3个片段作为模板，PCR扩增得到HJSP-S123；

4)HJSP-S123纯化后经RsrII、AscI双酶切，连接到相同双酶切的pWSK-HB-1/3.9质粒中，完成PRRSV嵌合质粒的构建，命名为pW-HJSP；

步骤1)中PCR扩增使用的引物为JX-S2F和JX-S2R，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2、3所示；步骤2)中PCR扩增分别以HB-S1F、HB-S1R和HB-S3F、HB-S3R为引物，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.4-7所示；步骤3)中PCR扩增的引物为HJ-fusionF和HJ-fusionR，其核苷酸序列如SEQ ID NO.8-9所示。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤(2)嵌合病毒RvHBJX的拯救通过以下方法来实现：

1)用Rsr II、Pac I内切酶消化pW-HJSP全长cDNA克隆质粒，使质粒线性化；获得的线性化质粒经酚氯仿抽提及无水乙醇沉淀、干燥后，紫外分光光度计测定纯化后质粒的浓度；

2)进行体外转录；

3)转录产物经TURBO DNase I消化后，用DMRIE-C脂质体转染MARC-145细胞，每天观察并记录细胞病变CPE的产生情况，将出现明显CPE的细胞培养上清在MARC-145细胞上进行连续传代，每代3-5d，获得的拯救病毒即为RvHBJX。

6.含有权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养病毒的疫苗。

7.权利要求1所述猪繁殖与呼吸综合征嵌合病毒或其传代培养病毒在制备疫苗中的用途。