[发明专利]一种白头翁植株再生方法

说明书

技术领域

本发明涉及白头翁的再生方法，属于生物技术领域。

背景技术

白头翁Pulsatilla chinensis(Bge)Regel是毛茛科(Ranunculaceae)，白头翁(Pulsatillae)属多年生草本植物，根入药。主要分布于东北、西北、华北和华东等地。全草含三萜皂苷，具有镇静、抑制肿瘤细胞、杀菌、杀精、预防爱滋病等功能，治疗老年性痴呆效果显著，此外，还可作观赏花卉美化环境，用于制造生物农药和除草剂。然而，野生资源的匮乏严重影响中医临床用药及制药企业的生产，应用组织培养技术缓解这一状况成为迫切需要。

植物离体再生通常是首先形成愈伤组织，然后分化出新的器官或胚，或不经过愈伤组织而直接发育形成新的器官或胚。然而，离体培养的植物组织有时会进入一种特殊而稳定的状态，外部形态上，它是一种致密的球形细胞团，彼此独立而又常聚生在一起，称为分生结节(Meristematic nodule)，合适的条件下可直接再生芽、根、叶状体等植物器官。目前仅在啤酒花(Humulus lupulus)、杨树(Populus)、桉树(Eucalyptus spp.)、菊苣(Cichorium intybus)及牡丹(Paeonia×Lemoinei‘Golden era’)等植物中研究较多。但有关白头翁分生结节途径植株再生的研究极少，因此，白头翁的植株再生技术对于其在中医临床及制药中的应用非常关键。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种以白头翁的叶片、叶柄为外植体，通过分生结节途径诱导白头翁植株再生方法，通过诱导的分生结节的组织解剖学的观察证实白头翁的外植体可通过分生结节途径可进行器官分化和发生体细胞胚。

一种白头翁植株再生方法，包括以下步骤：

选材：以野生白头翁细嫩的叶片或叶柄为外植体；

外植体消毒：流水冲洗后用洗涤剂溶液浸泡，再用自来水冲洗，滤纸吸干水分，在超净工作台用次氯酸钠溶液浸泡，再用灭菌水淋洗，用灭菌滤纸吸干表面水分，洗涤剂为常用洗涤剂；

不定芽诱导：叶柄切成段，叶片切成块，分别用解剖刀均匀割划至少两刀，并分别接种到不定芽诱导培养基上进行不定芽诱导；

不定芽增殖：将不定芽均切成小块儿接入增殖培养基中培养6周；

生根诱导与移栽：将增殖培养基中白头翁小植株转入生根诱导培养基中进行培养，然后移栽到基质中。

次氯酸钠溶液为1％的次氯酸钠溶液。

次氯酸钠溶液中加入有吐温20。

诱导培养基为：MS培养基分别添加不同浓度0～3.0mg·L^-1的玉米素(Zeatin)、激动素(Kinetin)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)，30g·L^-1的糖，0.8％的琼脂，pH为5.8，吲哚乙酸(IAA)浓度为0.05mg·L^-1。

不定芽诱导在24～26℃、16h·d^-1光培养，光照强度4000μmol·m^–2·s下培养。

增殖培养基为MS培养基，同时加入浓度为1.5mg·L^-1的玉米素和0.05mg·L^-1的吲哚乙酸。

生根培养基为1/2MS培养基中加入0～3.0mg·L^-1萘乙酸。

基质选用丹麦品氏托普基质珍珠岩按3︰2配成，并进行高压灭菌。

本文所用MS培养基基本组成如表1所示：

表1：MS培养基基本组成表

本发明的有益效果在于：白头翁外植体可通过分生结节途径不仅可进行器官分化，而且发生体细胞胚，这对植物离体再生新途径的研究提供了新的理论依据。

具体实施方式

下文将结合具体实施例详细描述本发明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。

实施例1

本实施例中材料为野生白头翁，外植体为幼嫩的叶片、叶柄。材料用流水冲洗2～4h，然后加入几滴洗涤剂浸泡10min，并用自来水冲洗至无泡沫为止，用滤纸吸干水分。在超净工作台上用加1滴吐温20的1％次氯酸钠浸泡20min，中间摇动几次，再用灭菌水淋洗5～6次，放在灭菌的不锈钢盘子里，用灭菌滤纸吸干表面水分，备用。

实施例2