[发明专利]包含POKEMON基因的siRNA的运输载体颗粒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种以乙型肝炎病毒核心蛋白作为载体将POKEMON基因的siRNA包裹于其中的制备方法。

背景技术

目前研究显示，哺乳动物乙型肝炎病毒的核壳或核心含有由183或185个氨基酸残基构成的序列。若干种嗜肝DNA病毒的乙型肝炎核心蛋白单体可在受感染细胞中自组装成被称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)的稳定聚集体。业已报导了HBc颗粒的两种三维结构。第一种结构包括含有二聚体形式的90个拷贝的HBc亚基蛋白或180个独立单体蛋白的小群体，第二种结构包括含有二聚体形式的120个拷贝的HBc亚基蛋白或240个独立单体蛋白的大群体。这些颗粒分别被称为T＝3或T＝4颗粒，其中“T”为三角划分数。这些人感染性病毒的HBc颗粒的直径分别为大约30或34nm。

POKEMON是POK转录抑制因子家族成员之一，它包括一个氨基末端POZ/BTB结构域和羧基端Krüppel型锌手指结构域，是T淋巴细胞、B淋巴细胞和红细胞系发育和成熟的重要因子。POKEMON基因在乳腺癌、肝癌和淋巴瘤等肿瘤的异常表达在癌基因转化和肿瘤的发生过程中发挥重要的作用。POKEMON是一种新发现的致癌基因，它能够导致其它致癌基因发作，最终促使肿瘤形成。POKEMON可以使癌细胞获得抗老化和死亡的能力，因此被称为癌症的“总开关”。重点是细胞内POKEMON基因的缺失不会对细胞的正常生长造成影响，这为设计低副作用的特异性抗癌药物提供了可能。

RNA干扰技术被形象地称为基因敲低(knock-down)或基因沉默(gene silencing)，是一种典型的转录后基因调控方法，又称转录后基因沉默(post-transcriptional genesilencing，PTGS)，是一种快速、高效的抑制特异性基因表达的方法，其最关键的效应分子就是具有21-23nt碱基的短片段双链RNA分子，称之为siRNA，能够以序列特异性地结合靶mRNA并使mRNA降解。由于RNA干扰具有高效、特异性，siRNA介导的转录后基因沉默是针对靶向基因的外显子序列，对其启动子或内含子序列却没有效应，是一种转录后基因表达调控机制，且不诱导非特异性的干扰素激活途径，因而成为继反义核苷酸、核酶技术之后一种新的分析功能缺失表型的工具，为基因功能研究和基因治疗开辟了新的道路，目前已广泛用于抑制特定基因的表达研究，特别是靶向恶性肿瘤中高度表达基因的研究。使用siRNA的基因治疗的关键在于以最小的副作用和最高的给药效率将siRNA传递到期望组织。然而，siRNA具有低的细胞透性，并且因在生理环境下等对基因的降解酶敏感而不能维持必要的浓度，从而易于分解，无法达到理想效果，导致siRNA作为药物使用受到限制。

发明内容

为了克服上述问题，基因的载体变得尤为重要，本发明拟在研究一种可将siRNA包裹于其中，能有效地循环而不被活体中的免疫细胞移除或排出，保护siRNA不被活体细胞中的酶 分解的运输载体。并且不会改变或降低siRNA抑制POKEMON基因表达的作用。

本发明的目的在于提供4对针对人POKEMON基因的siRNA序列，能抑制人POKEMON基因表达的siRNA用于肿瘤基因治疗，来抑制肿瘤细胞的生长。

本发明首先提供了一种降低POKEMON基因表达的小分子干扰RNA(siRNA)，包括正义链和反义链，序列如下：

siRNA1正义链：5’-CCCACCACAAACGUAGAAUUU-3’

反义链：3’-UUGGGUGGUGUUUGCAUCUUA-5’

siRNA2正义链：5’-GACCUUAAAUGAUUUCUGUUU-3’

反义链：3’-UUCUGGAAUUUACUAAAGACA-5’

siRNA3正义链：5’-CUGACGUGAAGAGGUCUUAUU-3’

反义链：3’-UUGACUGCACUUCUCCAGAAU-5’

siRNA4正义链：5’-CUCUGUGACACACACAUCUUU-3’

反义链：3’-UUGAGACACUGUGUGUGUAGA-5’

本发明所述小分子干扰RNA(siRNA)针对的POKEMON基因的靶序列如SEQ ID No.1-4所示。

SEQ ID No.1：AA CCCACCACAAACGTAGAAT CC