[发明专利]一种新的治疗肺癌的Derp1纳米疫苗及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及新型疫苗发明领域，具体地说是一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗及其制备方法和用途。

背景技术

肺癌已经成为全球范围内所有癌症发病率的首位，其五年存活率大约为15％，约30-40%的肺癌患者发生骨转移，一旦发生骨转移，其中位生存时间只有7个月。美国2012年肺癌有超过163万新发病例及57万死亡病例。肺癌同时也超过肝癌成为了我国第一大高发癌症，且发病率及死亡率增长最为迅速，每年以13%的速度增长。目前，肺癌占据癌症发病率排行（男女综合）的首位，其中在男性发病率中排第一，在女性癌症发病率中也始终排在前三位。预计到2025年，中国每年新增肺癌病例将超过100万例。肺癌患者还呈现年轻化趋势，尤其是近几年来，45岁以下的肺癌患者多有出现。因此，肺癌已经严重影响威胁我国人民的生命健康。

目前治疗方法主要有手术治疗、化疗、放疗等方法。纵观目前的疗法，手术治疗主要适合早中期（I~II期）肺癌和肿瘤局限在一侧胸腔的部分选择性的IIIb期肺癌，和放疗同属局部治疗，从肿瘤生物学角度看，癌症是全身性疾病，存在转移和扩散的特性；常规的放疗和化疗等治疗方式，在杀死肿瘤细胞的同时也损伤机体正常细胞和免疫系统，降低免疫力，毒副作用大。因此，开展新的抗癌药物的研发重要且必要，寻找对抗癌效果好且对正常组织毒害小、不损害机体免疫的药物的确迫切需求。经过我们发明人前期研究表明，屋尘螨Der p1疫苗对肺癌的治疗有着显著的作用，且能增强机体免疫能力，具有抗癌功能。

本发明采用基因工程技术在大肠杆菌中克隆和表达制备重组Der p1蛋白，克服了从螨体中大量提取的困难。同时采用PLGA纳米佐剂制备尘螨重组变应原Der p1疫苗，用于治疗肺癌。本发明国内外尚未见报道。

发明内容

本发明的目的之一是克服现有技术的上述不足，而提供一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗。

实现本发明上述发明目的的技术方案是：一种新的治疗肺癌的Der p1纳米疫苗，其是采用如下步骤制备而成的：

步骤一，用基因工程技术制备重组屋尘螨变应原Der p1：

（1）挑取单个含重组表达质粒重组pET-24a(+)Der p1的基因工程菌菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的LB中，35~37℃，160~240rpm摇菌过夜，按1~4%的接种量将基因工程菌菌落接种于LB/kam培养液中，200~300rpm摇菌至OD600为0.5~0.7时，加入IPTG使其终浓度为0.1~0.4mM，诱导4~6小时后，2000~4000g在2~6℃离心5~15min，去上清，沉淀用1xPBS洗涤，将细菌重悬于40ml 1xPBS/5mM EDTA中，加入溶菌霉至终浓度0.4~0.6mg/ml，DTT至终浓度5~15mM，PMSF至终浓度0.8~1.2mmol/L，Triton X-100至终浓度0.8~1.2%，并于室温中振荡20~40分钟，制成基因工程菌培养物裂解液，-80℃保存；

（2）将裂解液置于冰浴下40W超声5~15遍，超声20~40s、停20~40s，直至菌体不粘为止，10000~12000g3~5℃离心10~20min，去上清，得基因工程菌包涵体；

（3）在冰浴下，用100ml包涵体洗液1重悬沉淀，并磁力搅拌20~40min，10000~12000g3~5℃离心10~20min，去上清，再依次用包涵体洗液2和包涵体洗液3重悬，冰浴磁力搅拌，离心去上清，最后将沉淀溶于20ml包涵体溶解液中，10000~12000g离心30min，弃沉淀，得包涵体；

由于重组蛋白N-端带有6-His标签，故通过Ni²⁺金属螯合层析进行重组Der p1亲和层析纯化，得重组屋尘螨变应原Der p1；

步骤二，制备PLGA-尘螨应变原Der p1﹙PLGA-Der p1﹚纳米疫苗：

称50mg PLGA溶于二氯甲烷中，再加入100μL已制备好的浓度为100mg/ml的重组屋尘螨应变原Der p1，混旋1min，40w，超声乳化1 min形成初乳液，再加入2ml 浓度为2%的聚乙烯醇(PVA)，再超声乳化1~2 min，形成复乳液，然后将复乳液转移至50ml的双蒸水中，室温下搅拌3~5h，使有机溶剂充分挥发，10000rpm/ min离心10min，离心收集微粒，再用双蒸水洗涤，最后真空冷冻干燥成微粒粉末状的PLGA-尘螨变应原Der p1纳米疫苗，4℃保存。