[发明专利]禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法。

背景技术

禽流感(Avian influenza)于1878年首发于意大利，后证实是由A型流感病毒引起。之后，禽流感不仅给畜牧业带来巨大的经济损失，而且严重威胁到人类的健康和生命。目前已有多个国家出现H5N1亚型禽流感病毒感染人的情况。在2005年10月，我国安徽省发生首例确证的人感染H5N1亚型禽流感病毒病例，并分离到我国首株人H5N1亚型禽流感病毒A/Anhui/1/2005。2011年12月31日，我国深圳一人感染高致病性禽流感病毒并死亡。虽然深圳市疾控中心宣布此毒株不会人传染人，但是世界卫生组织证实了禽流感病毒在某些条件下可以以人传染人方式传播。所以，研制新型高效、安全的禽流感疫苗已成为病毒学工作者的重要任务。

目前，主要是通过接种疫苗来预防该病的发生。常规灭活疫苗对该病的免疫效果不佳，而弱毒疫苗则存在潜在的生物安全问题。因此，开发新型、高效、廉价、安全的疫苗势在必行。随着分子生物学技术的飞速发展，学者们不断进行着新型基因工程流感疫苗的研究。

现有技术中，无论制备核酸疫苗还是制备其他基因工程疫苗，相关抗原的制备都是必要技术条件。HA蛋白为AIV的表面糖蛋白，病毒感染后能够诱导机体产生特异性抗HA蛋白的抗体，该抗体具有病毒中和作用，因此，HA基因在流感病毒基因工程疫苗中被作为重要的靶抗原。

然而仅仅确定HA蛋白或HA蛋白表达基因作为抗原只是从基础角度确定可用的抗原类别。在此基础上如何开发一种表达稳定、安全性高的HA蛋白(或HA基因)表达系统成为了成功开发相关疫苗的技术关键。此外，如果该表达系统能够共表达多种AIV病毒亚型抗原将为制备禽流感病毒多价疫苗奠定了良好的技术基础。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，以解决现有技术中HA基因表达系统表达效率较低的技术问题。

本发明解决的另一技术问题是现有技术中无法以一个表达系统共表达多种病毒亚型抗原的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种禽流感病毒HA基因重组腺病毒的制备方法，该方法包括以下步骤：

1)将具有禽流感病毒HA基因的片段连接到腺病毒穿梭质粒上，将连接产物导入大肠杆菌中扩增，而后提取重组腺病毒穿梭质粒；

2)将步骤1)提取得到的重组腺病毒穿梭质粒经单酶切后导入含有腺病毒骨架质粒的大肠杆菌中进行同源重组，而后提取重组腺病毒质粒；

3)将步骤2)提取得到的重组腺病毒质粒线性化后转染293细胞，包装，即得到禽流感病毒HA基因重组腺病毒；

在此基础上，所述具有禽流感病毒HA基因的片段是连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段。

优选的，所述连接有CAG启动子的禽流感病毒HA基因片段是通过以下方法制备的：将禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体连接，而后将连接产物导入大肠杆菌扩增，而后提取重组质粒，而后酶切得到CAG-HA基因片段。

优选的，所述禽流感病毒HA基因有两种，分别是H5N1型禽流感病毒HA基因和H9N2型禽流感病毒HA基因，先完成其中一种禽流感病毒HA基因片段与pCAGGS载体的连接，而后再与另一种禽流感病毒HA基因片段连接。在该优选方案中连接得到的产物结构为-CAG-HA(H5N1)-CAG-HA(H9N2)-。

在以上任一技术方案基础上可以执行以下优选：

步骤1)所述腺病毒穿梭质粒是pShuttle质粒；

步骤1)所述的大肠杆菌为DH5α大肠杆菌。

步骤2)所述大肠杆菌为BJ5183大肠杆菌。

步骤2)所述的腺病毒骨架质粒是腺病毒骨架质粒pAdEasy-1。

步骤2)所述的单酶切是利用Pme I酶实现的。

步骤3)所述的293细胞为AD293细胞。

步骤3)所述的线性化是利用Pac I酶实现的。

CAG启动子是人工构建的组合启动子，由巨细胞病毒早期增强子(early enhancer element)和鸡β-肌动蛋白(chicken beta-actin)启动子组成，本发明以CAG为启动子表达目的基因，显著提升了目的基因的表达水平。