[发明专利]一种用于检测转移性结直肠癌二线化疗药FOLFIRI疗效生物标志物组合及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及微小核糖核酸(microRNA,简称miRNA)的应用，具体涉及一种用于检测转移性结直肠癌FOLFIRI化疗疗效的生物标志物组合及其应用。

背景技术

结直肠癌是一种原发于大肠的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌。结直肠癌因其发部位不同而表现出不同的临床症状及体征，主要有腹痛、便血、腹部包块、肠梗阻等，伴或不伴贫血、发热和消瘦等全身症状。在我国，结直肠癌作为第三大肿瘤，其发病率及死亡率近年来逐年上升。由于诊断技术的不断提高，使新发结直肠癌病例中非转移性疾病的比例大大增加，对于这部分患者，外科手术及辅助化疗是主要治疗手段。但是目前尚缺乏有效的预后判断及化疗疗效评价指标。目前临床上主要依据基于临床病理指标(如肿瘤大小、淋巴结转移数目、远处转移、组织分级等)的TNM分期作为疾病预后的判断及指导临床治疗，但根据此分期判断患者预后存在较大的异质性，亦不能预测肿瘤患者对化疗的反应。

50％结直肠癌患者最终会进展为转移性疾病而死亡。转移性结直肠癌患者仅有极少数可以经手术及化疗而得到治愈，全身化疗是这类患者的主要治疗方法，以氟尿嘧啶药物为基础联合伊立替康(FOLFIRI)或者奥沙利铂(FOLFOX)方案已成为晚期结直肠癌的标准治疗方案。

目前尚无有效指标可以预测患者对FOLFIRI化疗方案的敏感性，我们从miRNA的角度通过对患者接受化疗前的血清样本进行比对，分析miRNA表达水平与化疗敏感性的关系。

发明内容

本发明的目的就在于通过对患者接受化疗前的血清样本miRNA进行检测和比对，分析miRNA表达水平与化疗敏感性的关系，联系患者的生存资料及治疗效果，筛选一组与转移性结直肠癌FOLFIRI化疗疗效及预后相关的血清miRNA，并利用这些miRNA的TaqMan探针制备出适用于临床诊疗用途的试剂盒，为预测转移性结直肠癌患者FOLFIRI化疗敏感性提供特异性的以及迅速的无创伤性检测手段。

以下是对本发明的进一步描述：

一种用于检测转移性结直肠癌FOLFIRI化疗疗效和/或预后的miRNA组合，其包括下列miRNA：miR‐135b、miR‐10a和miR‐627。

上述miRNA组合的筛选方法包括以下步骤：

(1)分别收集12例对FOLFIRI敏感和不敏感患者化疗前混合血清样本，提取总RNA；

(2)采用高灵敏度、高精确性和高重复性的低密度芯片技术(TaqManlowdensityArraytechnology)进行miRNAs检测，筛选在化疗敏感组及不敏感组间稳定差异表达的一组miRNA；

(3)用实时荧光定量PCR方法(TaqMan探针法)对一组标本进行逐个检测，从低密度芯片方法初筛出的miRNA中复筛出表达差异显著miRNA；

(4)进一步用定量PCR方法对大批量标本进行逐个验证，筛选出稳定的表达差异显著的一组miRNA。

具体来说，上述筛选方法包括以下步骤：(1)收集接受FOLFIRI患者化疗前混合血清或血浆样本，提取总RNA；(2)运用低密度芯片技术对上述RNA进行检测，初筛出在化疗敏感组及不敏感组间稳定差异表达的一组miRNA；(3)将抽提的RNA逆转录为cDNA，采用荧光定量PCR(TaqMan探针法)对初筛出的miRNA进行复筛和验证，挑选出稳定、特异表达的一组miRNA。

本发明使用的检测方法可以选自：RT‐PCR方法、低密度芯片技术(TaqManlowdensityArraytechnology)、Real‐timePCR方法中的一种或几种。例如，血清中miRNA分子的检测方法包括以下步骤：

(1)使用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取血清总RNA；

(2)通过RNA逆转录反应得到cDNA；

(3)利用TaqMan探针法进行PCR反应；

(4)进行PCR产物的琼脂糖凝胶电泳；

(5)EB染色后在紫外灯下观察结果。

本发明还提供了一种用于检测转移性结直肠癌化疗疗效和/或预后的miRNATaqMan探针组合物，包括miR‐135b、miR‐10a和miR‐627的TaqMan探针。

上述TaqMan探针组合物优选包括以下序列所示的TaqMan探针中的一种或多种：