[发明专利]一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用

说明书

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种血管活性肠肽的融合蛋白，所述融合蛋白包含1个人血清白蛋白（Albumin Human，HSA)和1个血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide，VIP）,该融合蛋白所具有的独特的氨基酸序列可以保证其在宿主体内高水平稳定表达，在保留VIP原有功能的同时，体内半衰期显著延长。本发明同时提供该融合蛋白的制备方法及其在制备抗炎、抗损伤、脑血管疾病、提高睡眠质量的药物中的应用。

技术领域

本发明属于基因工程制药领域，具体涉及一种血管活性肠肽的融合蛋白及其制备方法和应用.

背景技术

血管活性肠肽(vasoactive intestinal peptide，VIP)是一种由28个氨基酸组成的多肽，主要是由外周神经和中枢神经系统产生，由副交感神经节后纤维释放，并且与乙酰胆碱共同存在，被认为是胰高血糖素-胰泌素家族的一员。广泛分布在中央神经系统的类胆碱突触前神经细胞和外周肽能神经细胞中，通过它可对多种器官进行神经支配，比如心脏，肺，消化系统和泌尿生殖道，眼睛，皮肤，卵巢和甲状腺。

VIP在中枢和外周神经系统中是一种重要的信号肽，通过其受体发挥生理作用，迄今为止，已有3种类型的VIP受体被克隆和分类，分别为VPAC1、VPAC2和PAC1。血管活性肠肽在生物体内涉及到多种生物学功能，包括参与新陈代谢、外分泌和内分泌、细胞分化和平滑肌舒张、激素分泌和免疫应答调控。基于它的多种生物学功能，VIP被认为是一种对多种疾病包括糖尿病、哮喘，阳痿和风湿有治疗前景的药物候选物。

VIP具有广泛的生物学活性，表明VIP具有广阔的临床应用前景。但是，到目前为止只开展了少数临床实验。VIP临床应用的一个主要障碍就是它在体内受到蛋白酶作用、抗体中和、自发水解而半衰期很短，这使VIP在体内半衰期不足1分钟。为了延长VIP的半衰期，就要通过对其进行结构的修饰和改造以及其他方法来提高其稳定性。

尝试提高VIP的稳定性的方法，包括对其母体进行化学修饰、使用稳定的VIP受体激动剂或VIP类似物、VIP与肽酶抑制剂组合使用或将VIP准确地嵌入到微粒或纳米粒子中。氨基酸的化学修饰或替换作为一种常用的方法早已被提出并用来增加神经肽的稳定性。Onoue和他的同事得到了两个VIP的衍生物具有相当可观的稳定性(在40℃超过60天)，它被做成可吸入的粉末制剂在哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)模型上具有一定功效。但是这些VIP的衍生物在治疗其他疾病上面受到了限制。之前也有提出使用微胶粒或脂质体包埋神经肽使其在体内缓慢释放，近期这种方法也被用于VIP的体内抗炎模型的应用上。然而这种脂质体包埋的神经肽进入目标器官受到了其颗粒大小的限制。为了克服这个潜在的问题，一个研究描述了一种将VIP包埋于由银保护的纳米粒子，它的功能和体内固定VIP的小神经胶质细胞相类似，这项研究第一次提供了使用金属纳米粒子对神经肽靶向给药的资料，但是在炎症状态下的基于纳米粒子的治疗效果还需进一步证明。虽然已有多种延长VIP在体内半衰期的方法，但是仍需找到一种简单、经济且安全可靠的方法。

以人血清白蛋白(Albumin Human，HSA)为载体的融合蛋白技术是一个受关注的延长蛋白质半衰期的方法。由于HSA是人血清的主要成分，对体内血浆体积和渗透压的维持起到了至关重要的作用，而且无酶活性和免疫原性，人体相容性好，分子量大(约为66KDa),具有非常低的肾清除率，半衰期长，约为19天，微生物发酵表达量高等优点，在体内常作为体内因子和药物的转运载体。通过构建融合蛋白技术增加多肽/蛋白类药物分子量可延长药物半衰期。所以，HSA可以作为小分子蛋白在血液中的载体，从而延长小分子蛋白在人体内的半衰期。Yeh等的研究发现，通过克鲁维氏酵母表达的HSA-CD4融合蛋白在以家兔作为动物模型的实验中，其半衰期达到了CD4单体的140倍。通过维氏酵母表达的HSA-IFNα融合蛋白，它的半衰期在猕猴体内比IFNα单体延长了18倍。