[发明专利]一种柴胡脱毒组培快繁的方法

说明书

技术领域

本发明属于中草药脱毒组培快繁技术领域，尤其涉及一种柴胡脱毒组培快 繁的方法。

背景技术

柴胡为多年生草本植物，株高40～85cm，复伞形花序，花黄色，根有不规 则分枝，粗细不等，主根常不明显，皮有黑色、白色，植株生长早期，以地上 部茎叶生长为主，后期生长根。柴胡根茎入药，具有疏肝解热、止痛之功效， 主治感冒、发热、慢性肝炎、肋痛或肋间神经痛、妇科疾病等。据有关报道， 柴胡的年需求量在300万公斤以上，其具有药用价值高、开发前景看好、行情 稳定等特点。近年来，随着生态环境的破坏以及无节制地采挖，柴胡野生资源 枯竭，而人工栽培由于要求技术含量高，难以满足市场需求。

目前，人工栽培柴胡一般采用大田直播和育苗移栽方法，大田直播出苗率 低、药材品质差，已不能满足市场需求。育苗移栽是以温棚育苗，然后进行炼 苗并进行大田移栽，移栽成功率低，病菌感染严重，使其产量和药用成分均下 降，致使柴胡的栽培生产受到很大限制。因此为了提高柴胡的繁殖系数，适应 大规模种植的需要和减低病毒对品质的危害，对柴胡进行脱毒组培快繁研究具 有重要的价值。

组培与脱毒苗生产的关键是脱毒技术，获得无病毒植株的方法有多种，例 如热处理脱毒、茎尖培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒以及组合方法。普遍采用的较 好的方法是茎尖培养脱毒法，具体的步骤是：通过植物顶端分生组织切取茎尖 (0.2mm以下分生组织)，诱导愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成 小植株得到脱毒苗是目前通常采用的方法。相关的技术已有许多的专利。例如， CN1031637A公开了采用茎尖作为外植体，经茎尖培养后得到脱毒苗的方法。 CN1475107A发明名称为“柴胡规模化组培快繁方法”公开了在无菌条件下用解 剖针剥取试管苗的茎尖(0.3～0.6mm)，采用常规方法进行培养，获得大量脱 毒组培苗。但是这种茎尖分生组织脱毒法存在的问题是：要切取很小的茎尖分 生组织，需在显微镜下操作，具有一定难度；切取茎尖组织越小，成活率越低， 而切取茎尖组织偏大，又不能完全脱除病毒，同时容易造成污染；因此，仍需 要一种更好的脱毒方法。

发明内容

本发明目的是克服以上存在不足，提出一种无需切取微小植物茎尖，即能 大量快繁柴胡脱毒组培苗的方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

一种柴胡脱毒组培快繁的方法，按如下步骤进行：

1)培养基的配制，包括基本培养基和组培各阶段培养基，各培养基的组分 重量为：

①基本培养基：选用MS培养基，蔗糖25～35g/L，琼脂7～9g/L，蛋白胨3～ 8g/L，腐殖酸0.5～0.8g/L，pH5.8～6.5；

②诱导培养基：MS中添加6-BA0.5～1.5mg/L、α-萘乙酸钠0.1～0.2mg/L、 NAA0.15～0.5mg/L以及维生素B20.001～0.002mg/L；

③愈伤组织分化培养基：MS中添加6-BA2.5～3.0mg/L和NAA0.2～0.3mg/L 以及维生素B20.001～0.002mg/L；

④增殖培养基：MS中添加6-BAl.0mg/L和NAAO.3mg/L；

⑤生根培养基：1/3MS中添加NAAO.1mg/L和卡拉胶0.5～0.8g/L；

2)外植体的选取与灭菌：取柴胡的种子，经灭菌处理，作为脱毒组培用的 外植体；

3)诱导培养：将步骤2)灭菌处理后的种子接种在诱导培养基上，直接形成 无根组培苗或先形成愈伤组织，再将愈伤组织移植至分化培养基诱导出丛芽， 形成无根组培苗和珠芽；

4)增殖培养：将步骤3)直接形成的无根组培苗或先形成愈伤组织，再经分 化培养基诱导形成的无根组培苗和珠芽接种在增殖培养基上，诱导出丛芽，形 成无根组培苗和珠芽；

5)生根培养：将步骤4)增殖形成的无根组培苗和珠芽接种在生根培养基中 进行生根培养；

6)移栽：当步骤5)的生根组培苗生长至4～7cm以上、生根珠芽0.3～0.7cm 以上，移栽基质培养至成苗；

7)病毒检测：利用RT-PCR扩增技术，构建其基因组序列克隆，原核表达制 备病毒特异性的抗血清，建立ELISA检测技术进行柴胡大豆花叶病毒、芋花叶 病毒、马蹄莲花叶病毒的检测。