[发明专利]一种用于监测血管重构现象的方法与试剂盒

说明书

本发明涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重构现象的试剂盒。本发明所述方法是将体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；或者将血管组织制备成石蜡切片；用稀释的细胞核增殖抗原Ki67覆盖，染色，荧光显微镜观察。本发明突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研究。本发明所述试剂盒特异性高，适用于基础与临床研究中体外培养细胞爬片、细胞涂片和各类组织切片中的组织细胞同时出现细胞增殖、凋亡以及静息情况研究。

技术领域

本发明涉及一种用于监测血管重构现象的方法，以及涉及相应的用于监测血管重构现象的试剂盒。

背景技术

冠脉血管架桥是将病人自体静脉移植到冠状动脉替代原有病变的动脉血管的一种常见外科手术方法，是目前临床治疗因冠脉粥样硬化导致心肌梗死最重要手段之一。由于移植血管在一年内有15％、3～5年内有30％、5～10年内有50％的移植血管出现重阻塞，导致移植手术最终失败，给家庭、给社会以及经济造成很到损失。人们对于如何防止移植后血管重阻塞的机制迄今仍不清楚。

目前，人们普遍认为，移植血管组织重构主要是由于血管平滑肌细胞的增殖过多、死亡过少而形成，因而人们对移植血管的病理生理变化的干预研究要么只是监视细胞增殖及相应机制，要么只是观察血管组织的细胞死亡及机制。

发明内容

本发明突破了传统上对于血管重构现象只监视细胞增殖或者只监视细胞凋亡的方法，首次提出了一种新的用于监控血管重构现象的方法，同时对细胞增殖和细胞凋亡进行观察，能够更有效地对移植血管的病理生理变化进行干预研究。

本发明所述的用于监测血管重构现象的方法是基于发明人的最新研究成果，即血管重构(包括移植静脉动脉化以及移植静脉粥样硬化过程)并不只是过去人们认识的细胞过度增生而细胞凋亡抑制，而是细胞大量增生的同时，细胞凋亡也大量出现。本发明的实验结果表明：一部分细胞(原来存在于血管壁上的干细胞或成纤维细胞)接受外来刺激后立马开始分化和增生，继而开始合成大量的细胞外基质，分布到细胞外的血管膜上，使得血管壁快速增加变厚，以快速抗衡和适应外来压力对管壁的伤害。与此同时，原有的血管壁上的成熟的平滑肌细胞在突发外来伤害因素(如高血压产生的机械牵张力以及糖尿病高血糖产生的AGEs等)作用下，细胞出现损伤进而通过凋亡的形式而被清除。在通过凋亡清理完第一批受损伤细胞后，新生的细胞在经历了大量细胞外基质合成后亦会变得衰老，最终也会通过凋亡的形式而被清除。只要外来伤害因子持续存在，血管的细胞(干细胞等)会不断被激活而出现细胞的增殖和合成细胞外基质，血管也随之变厚，同时完成了功能的细胞亦会衰老并经由凋亡途径而被清除。如此出现了血管中既可见有细胞大量增殖，亦可见其它细胞出现大量凋亡。因而，细胞增殖越多，细胞调亡也就越多，最终血管重构速度也就越快。由此建立本发明所述的用于监测血管重构现象的方法，通过对细胞增殖和凋亡同时原位三重检测(增殖细胞、凋亡细胞和静息细胞)来更有效和更准确的监测血管重构现象。

根据本发明的一个具体实施方式所述的用于监测血管重构现象的方法，包括以下步骤：

A.体外培养的血管平滑肌细胞进行因素处理而制备成细胞爬片；

B.用清洗液清洗，加入固定液覆盖染色标本，置于-20℃固定10分钟；

C.用清洗液清洗，加入脱膜液覆盖染色标本，20-25℃孵育10分钟；

D.用清洗液清洗，加入封闭液覆盖染色标本，置于湿盒中孵育30分钟；

E.用含1％BSA的PBS缓冲液稀释细胞核增殖抗原Ki67，稀释浓度为1：200，将稀释好的液体覆盖染色标本，置于湿盒中4℃孵育过夜；

F.用清洗液清洗，加入Cy3标记荧光二抗，参考稀释浓度为1：200，置于湿盒内室温孵育2小时；