[发明专利]苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用

说明书

本发明涉及一种苹果V‑ATPase亚基基因MdVHA‑B1S396A及其抗逆应用，从苹果中分离到了MdVHA‑B1基因，然后通过两轮PCR搭桥的方法将396位置处的丝氨酸残基突变为丙氨酸得到MdVHA‑B1S396A基因；该基因在苹果王林愈伤中过量表达能进一步提高转基因苹果愈伤的表达水平，同时进一步增强转基因苹果愈伤的抗盐等逆境能力。

一、技术领域

本发明涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A及其抗逆应用，具体涉及一种苹果V-ATPase亚基基因MdVHA-B1S396A的载体构建及其转基因苹果愈伤在抗盐逆境方面的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。

二、背景技术

植物一生中经常遭受各种不良环境和病虫害的侵袭，在长期的适应与进化过程中，植物形成了一系列防御反应机制，用来抵抗不良环境的伤害。其中，环境胁迫主要包括各种生物胁迫和非生物胁迫。生物胁迫主要来自昆虫、食草动物、植物病菌等；非生物胁迫种类众多，包括干旱、盐渍、极端温度、化学污染和氧损伤等胁迫。为了适应繁杂多变的环境，减少不利环境对机体的伤害，植物体内演化出了涉及多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程。

苹果是世界性果品，是温带地区的主要栽培树种。其适应能力较强，果品营养价值较高，耐贮性好，供应周期长，世界上很多国家都将其列为主要消费果品而大力支持。但是在苹果的生长发育过程中，许多非生物胁迫是影响苹果地理分布和产量提高的主要限制因子，尤其是高盐、干旱和低温等，世界苹果生产国都把选育抗盐、抗旱、抗寒等优质苹果新品种作为主要育种目标。由于苹果是多年生木本植物，遗传背景复杂、杂和度高、童期长、自交亲和性差等诸多问题给遗传育种带来了很大障碍，常规育种进展缓慢。而苹果愈伤组织是研究植物生长、分化、发育及抗性生理等良好的实验体系，也是植物种质离体保存、细胞工程材料创建以及遗传转化体系建立等重要工作的基础。并且近年来，随着苹果基因组的测序(Velasco等，2010)的完成、以及迅速发展的现代生物技术为解决这些问题开辟了新途径，通过基因工程技术有目的提高果树抗盐、抗旱、抗寒能力，成为果树遗传改良的重要研究方向，大量植物抗逆功能基因的分离和鉴定则为基因工程遗传改良提供了目的基因。

V-ATPase普遍存在于真核细胞中不同内酸性细胞器膜上。它是由两个亚复合体组成的多亚基酶：外部的V1复合体主要负责ATP水解，膜内嵌的V0复合体主要负责质子转运(Gaxiola等,2007)。V-ATPase活性主要取决于复合体的可逆组装和V-ATPase亚基基因的动态表达(Kane,2012；Liberman等,2013)。编码这些V-ATPase亚基的基因被确定与V-ATPase活性正相关，在植物(或细胞)生长发育及对非生物胁迫的响应中发挥至关重要的作用(Gaxiola等,2007；Silva和Gerós,2009；Hu等，2012)。在拟南芥和苹果中，V1亚基VHA-B存在三种亚型(为VHA-B1，VHA-B2和VHA-B3所编码)具有序列和功能上的差异(Gaxiola等,2007)。

目前对V-ATPase亚基基因的研究主要集中在拟南芥、水稻，小麦上等少数模式植物上，而在果树方面研究较少。由于诸多方面的原因，可耕土地面积越来越少，再加上低温、干旱、土壤盐渍化和病、虫害导致果树的种植面积和范围受到严重影响。因此挖掘苹果V-ATPase亚基基因并进行功能研究，为果树抗逆转基因育种提供潜在的有效候选基因，不但具有重要的理论意义，而且具有广泛的应用价值。苹果转基因育种多在苹果砧木上进行，而苹果砧木主要生活在地下，不开花坐果，减少了基因工程在果树应用上的争议。