[发明专利]一种新布尼亚病毒的恒温扩增检测试剂盒及检测方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种针对新布尼亚病毒核酸的恒温扩增快速检测技术，适合对新布尼亚病毒的定性检测。

(二)背景技术

新布尼亚病毒是发热伴血小板减少综合征的重要病原体，其主要通过蜱虫叮咬传播。电镜下病毒颗粒呈球形或椭圆形，直径约80nm～100nm，其基因组由大(L)、中(M)、小(S)3个单股负链RNA片段组成。病人感染新布尼亚病毒后引起发热伴血小板减少综合征，主要表现为急性起病、发热、恶心、腹泻、乏力、全身不适、呕吐、肌肉酸痛等，可因多器官功能衰竭死亡。新布尼亚病毒可以通过蜱虫叮咬传播，也可通过接触病人血液等传播。新布尼亚病毒感染需要实验室诊断技术加以确诊，因此建立快速、准确的诊断方法十分重要。目前新型布尼亚病毒的实验室检测技术主要基于针对病毒RNA的核酸检测技术(如荧光定量PCR等技术)，但由于需要昂贵的荧光定量PCR仪，使得难以广泛使用。恒温扩增技术是继PCR技术后近年发展起来的一种新的体外核酸扩增技术，本发明技术研制了恒温扩增新布尼亚病毒核酸，并结合核酸试纸条显色来判定检测结果，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。本发明研发的新布尼亚病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法检测时间短、反应灵敏、方法特异，为新布尼亚病毒检测提供了一种可靠的快速检测方法。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测新布尼亚病毒核酸的恒温扩增检测试剂盒及其检测方法。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种新布尼亚病毒恒温扩增检测试剂盒，所述试剂盒组成包括：

(1)RNA提取液，优选德国QIAGEN RNA提取试剂盒(Qia-74104)；

(2)恒温PCR扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆转录酶和无菌双蒸水；其中：

所述正向外围引物为：5′-TTGCTGCTTACAGGTTCCTG-3′；

反向外围引物为：5′-GAGGAGCCAGCAAGACAGA-3′；

所述两条探针的序列分别为：

正向5’端Biotin标记探针

5′-Biotin-GTCCCCAGCAGAGCTGCTGAG-3′；

反向3’端Fitc标记探针

5′-Fitc-GGGAAGAAGACAGAGTTCACAG-3′；

所述两条扩增交叉引物分别为：

扩增正向引物：

5′-AGGGAATCCTTGGCCCAGATGTAAGCAGCGGCAGCAAC-3′；扩增反向引物：

5′-TGGCCTTCAGCCACTTCACCTCAGGGATCCTCTCCATGC-3′；

(3)阳性对照：含有新布尼亚病毒的S基因片段的DNA质粒；

(4)阴性对照：无菌双蒸水。

进一步，本发明所述的1×Thermol buffer组成为：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及质量浓度为0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

进一步，本发明所述阳性对照为含有长189bp的新布尼亚病毒S片段基因序列，序列如(SEQ ID NO.1)：

TTGCTGCTTACAGGTTTCTGTAAGCAGCAGCAGCAACCTCA GCAGCTCTGCTGGGGACCCCATCTGGGCCAAGGATCCCCTTGGCCTTCAGCCACTTCACCCGAACATCATTGGGAAAGAAGACAGAGTTCACAGCAGCATGGAGAGGATCCCTGAAGGAGTTGTAAACCTCTGTCTTGCTGGCTCCTC。

进一步，本发明所述阳性对照按如下步骤制备：