[发明专利]一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备方法和应用。本发明通过抗原抗体结合活性筛选获得对乙肝病毒抗原有较高亲和活性的特异乙肝抗体，所述抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示。本发明通过借助蛋白分子模建技术分析抗体突变热点，并以氨基酸为单位对其进行饱和突变，构建突变库并进行生物学验证，实现了抗体的优化。本发明不仅为阻止乙肝病毒感染，同时也为其治疗的研究奠定了基础，从而在临床中可用于由乙肝病毒感染引起的肝病的预防和治疗。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种人源抗乙肝病毒表面抗体及其制备方法和应用。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)感染引起的急、慢性乙型肝炎是严重危害人类健康，并有可能诱发肝癌的严重传染病之一，至今仍未有特异性药物可以用来完全控制其传染和流行爆发。抗乙肝病毒的抗血清曾被证实具有抗病毒感染的作用，尤其在阻断母婴传播及预防肝移植后HBV再感染方面疗效显著，但血源性抗血清存在着传播其它疾病的隐患,同时还有特异性不强,中和效果差等缺点，因此抗乙肝病毒重组抗体的研究具有重要的社会应用价值。

现有基因工程抗体主要包括两种：一是人源化抗体(嵌合或CDR移植抗体)，即仅保持抗体的CDR区为鼠源序列，将抗体包括骨架区在内的其它部分均换成人的序列，目前市售的绝大多数抗体属此种类型。改建后的“人源化”抗体在理论上既保留了亲代抗体的抗原特异性，又更大程度的消除了鼠抗体的抗原性。但由于它们还含有10％～30％的鼠源蛋白，因而在临床应用时，或多或少会存在一些免疫排斥反应。另一种则是消除抗原性的人源抗体，但与原亲本抗体相比，构建的人源化抗体和小分子抗体片段其亲合力和特异性通常较原亲本抗体低，完全人抗体更是低于人源化鼠单抗。因此筛选获得低抗原性高亲和活性的人源抗体具有重要应用价值。

目前抗体工程最常用的两种技术方法是抗体文库筛选和蛋白同源模建技术，其中抗体文库筛选更为常用，技术方法也从噬菌体抗体文库发展到核糖体展示、无细胞表达系统。

由于抗体的亲合力和特异性主要是由抗体的可变区决定的，因而对抗体进行亲合力成熟也主要是对可变区进行突变。保留抗体骨架结构，人工合成并替换部分CDR区，即可获得针对不同特异抗原不同亲和力的抗体。在轻、重链可变区中，与抗原结合最密切的是其六个CDR区，其中HCDR3和LCDR3对抗原结合的贡献最大，且HCDR3的多样性变化也最多，因此选择某一个或某几个CDR区，尤其是HCDR3和LCDR3进行突变是最常用的方法。利用不同的突变方法在CDR中引入突变并获得成功的报道很多，在体外通过控制突变引物的合成也可以满足不同的要求。但一个分子内发生突变较多时，除有些对抗体的性能有改善外，还有些是对抗体无影响的，甚至有些对抗体性能起破坏作用。突变的位点越多，产生的组合数量就越大，会远远超过抗体库的构建能力；此外，碱基突变方法往往容易引起多个密码子编码同一氨基酸或出现终止密码子而产生一些多余的寡核苷酸等现象，抗体库容量过大，目标抗体含量过少这都使抗体库筛选、鉴定工作变得更加困难。

另一种蛋白同源模建技术是基于蛋白质结构与功能之间的关系。目前，计算机数字化分析系统已经成为蛋白质工程研究中必不可少的工具，同源模建技术在蛋白质结构预测中发挥着举足轻重的作用。随着蛋白质组学的发展和海量数据的积累，与已知结构蛋白质有30％以上同源性的蛋白质的结构即可被较精确预测。人们可以根据已知的蛋白质一级序列信息，应用计算机技术对蛋白质二维及三维结构进行模拟预测，蛋白质的三维结构又在很大程度上决定了蛋白质的功能，该项技术也被研究者们应用于抗体研究。抗体作为空间结构较为保守的蛋白，可以根据已知抗体结构序列对已有的抗体分子加以改造，得到性能更符合人类要求的非天然免疫球蛋白结构。但由于已有蛋白空间结构数据积累远远小于一级序列的数据，不同抗体之间又仅存在微小差异，对模拟计算的精度要求较高，因此单纯采用计算方式获得的抗体还存在误差，不能完全代表抗体的特异性和亲和性。