[发明专利]（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方法

说明书

技术领域

本发明公开了一种（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的的生物合成方法，属于微生物技术领域。

背景技术

(R)-4-氯-3-羟基丁酸酯（CHBE）是一种重要的手性砌块，可用于合成(R)-γ-氨基-β-丁酸、L-肉碱和(－)-大内酰亚胺，还可转化生成(+)-负霉素和手性2,5-环己二烯酮的合成子。制备光学活性手性CHBE的方法可分为化学催化加氢法和生物催化法。其中，化学催化加氢法是以4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)为反应前体，以稀有金属铑的络合物为催化剂，进行不对称催化加氢制备对映体纯CHBE，此方法的优点是适合规模化生产，但是其具有催化剂价格昂贵、环境不友好和产物光学纯度不理想等缺点，并且在催化过程中需高压，因此对设备要求也较高。而生物催化法具有高活性、高立体选择性、反应条件温和及社会效益好等优点。因此，利用生物催化剂制备光学活性CHBE备受研究者的青睐。

生物催化不对称还原COBE主要是在脱氢酶或羰基还原酶的催化作用下进行，同时还需还原态辅酶NADH或NADPH的参与。然而，辅酶NADH或NADPH价格昂贵，因此限制了其应用。而利用全细胞内的辅酶循环系统，可经济地实现辅酶NADH或NADPH再生和循环（Wang L. J., et al. Bioresour. Technol. 2011, 102, 7023-7028）。然而目前一般文献中报道的羰基还原酶(R)-CHBE（e.e.>99%），其催化的底物COBE浓度较低，而且通常需要在反应过程中进行分批补料，或添加昂贵的NADH或者NADPH，从而才能达到一个令人较为满意的底物浓度。并且大部分文献报道的都是有关于(S)-4-氯-3-羟基丁酸酯[(S)-CHBE]的生物合成。因此，寻找一种高活性及选择性的还原COBE菌株合成(R)-CHBE成为当务之急。

本研究组利用基因组挖掘技术构建了重组还原酶菌株大肠埃希氏菌Escherichia coli。利用其全细胞催化剂，以葡萄糖为辅底物，加入低成本的NAD⁺，可实现辅酶再生，并实现了(R)-CHBE（e.e.>99%）及其衍生物的高效合成，其反应过程中不需进行分批补料，且在2 L的反应体系中，底物浓度能够达到800-6000 mM，(R)-CHBE产率可高达99.0%。因此具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是公开一种本发明公开了一种（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的的生物合成方法，以克服现有技术存在的上述缺陷。

本发明所述的大肠埃希氏菌Escherichia coli，该菌株已于2014年11月13日保藏在位于中国北京的北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No. 9955。

上述大肠埃希氏菌Escherichia coli，CGMCC No. 9955，用于（R）-4-氯-3-羟基丁酸乙酯及其衍生物的生物合成方法，按照下述步骤进行：

一、菌株的培养：

（1）种子液的摇瓶培养：将所说的大肠埃希氏菌Escherichia coli，采用本领域常规的方法，在种子液培养基中进行扩增培养，在25~37 ℃和pH 6.0~8.0条件下120~180 rpm的摇床上培养12~18 h；

（2）发酵罐扩大培养：在5 L发酵罐中加入50%-67%（体积比）的发酵培养基，接种量占发酵培养基体积的2%~8%, 接种至5 L发酵罐中，通气量1:0.1~1:1 (v/v/m)，搅拌转速300~400 rpm，温度25~37 °C，pH 6.0~8.0。细胞光密度OD₆₀₀=0.60时，加入诱导剂IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)。培养12~24 h后，离心、洗涤得到静息细胞。

二、静息细胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）及其衍生物：