[发明专利]南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说，涉及南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用。

背景技术

根结线虫是专性内寄生植物病原线虫，可寄生超过3000种植物，对农业生产造成严重危害，每年产生巨大经济损失，被称为世界上最具破坏性的植物病原物。在我国以南方根结线虫(M.incognita)分布最广，近几年来，我国农业种植结构不断调整，设施蔬菜栽培面积迅速发展，为南方根结线虫的发生、发展提供了适宜的环境，土壤中的南方根结线虫量快速增加，严重威胁我国农业生产安全。轮作、生物熏蒸、生物防治及化学农药是防治线虫的主要方法，但是存在防治效果差、污染环境等问题。巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)，是1966年发现的第一个可溶性淋巴因子，它可吸引巨噬细胞在迟发型变态反应中浸润、聚集，还可促进巨噬细胞增生以及刺激巨噬细胞分泌多种细胞因子。MIF作为一种潜在的促炎症细胞因子，是天然免疫和获得性免疫中的关键调节元件，通过多种途径促进免疫应答和炎性反应。哺乳动物(如人、小鼠、大鼠、牛等)的MIF蛋白氨基酸序列有90％的同源性，而且在鸡、鱼、蜱、寄生虫、蓝细菌等物种间有同源性和保守性。

RNA干扰(RNAi)是研究植物线虫的一种重要的反向遗传学手段。通过人工合成靶基因的dsRNA或siRNA，并溶解在线虫浸泡缓冲液中，在章鱼胺、间苯二酚等神经调节剂作用下，寄生前二龄幼虫摄取溶液中的dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体外RNAi技术(in vitro RNAi)；通过构建线虫靶基因的RNAi载体，并遗传转化寄主植物，使线虫在寄生取食时，从寄主植物细胞中吸取dsRNA或siRNA，从而引发内源基因的RNA干扰，称为体内RNAi技术(in vivo RNAi)。RNAi不仅有助于分析植物线虫的基因功能，而且可以评价目标基因作为抗线虫靶标的应用潜力。

尽管已经克隆了南方根结线虫大量与寄生致病相关的基因，但目前只有少数基因的作用机制被详细研究。大量研究表明，植物寄生线虫分泌的效应蛋白在与寄主互作致病过程中发挥重要作用。多数推测的寄生致病相关基因在线虫食道腺、体壁、口器等部位表达，编码产生分泌蛋白，再经由口针穿刺、注射或直接由体壁分泌进入植物细胞内，发挥寄生致病相关的复杂功能，大多数的研究集中在食道腺分泌的效应蛋白，但由线虫体壁分泌并参与免疫调节的相关寄生致病效应蛋白的研究结果不多。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了南方根结线虫MIF基因在降低线虫对植株致病性中的应用，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ ID No.3所示的CMIF基因。

所述BMIF基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，所述应用为通过抑制线虫MIF基因的表达，降低线虫对植物植株的为害。

本发明还提供了南方根结线虫MIF基因在培育抗南方根结线虫转基因植株中的应用，所述MIF基因为如SEQ ID No.1所示的AMIF基因、如SEQ ID No.2所示的BMIF基因或如SEQ ID No.3所示的CMIF基因。

进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的1-329bp或与其相似性大于90％的核苷酸序列作为RNAi干扰片段，构建RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转基因植物。所述构建的RNAi干扰载体，可沉默根结线虫的AMIF、BMIF和CMIF基因。

更进一步地，所述应用为将BMIF基因编码区的1-329bp作为RNAi干扰片段，按正反方向构建于pSAT5干扰载体Intron两侧，再将含有BMIF正反向干扰片段和Intron区的大片段用XbaI/KpnI双酶切从pSAT5载体上切下，连接于psuper植物表达载体，构建psuper-BMIF-Ri植物转基因RNAi干扰载体，通过农杆菌介导法获得抗南方根结线虫的转基因植物，其防治根结线虫的效果在70％左右。

本发明还提供了南方根结线虫BMIF基因，所述BMIF基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了用于克隆所述BMIF基因的引物，所述引物包括：