[发明专利]一株高凝聚性戊糖片球菌及其在净化水体中副溶血性弧菌中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株从发酵豆制品中筛选出的具有高凝聚活性的戊糖片球菌及其在净化水体中的副溶血性弧菌中的应用。

背景技术

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus），广泛分布于近岸海洋及江河入海口，是海产品引发食物中毒的重要病原菌，也是水产动物细菌性疾病的重要致病因子。目前，防治水生动物弧菌病、降低水体中副溶血性弧菌载量的重要手段是使用抗生素及化学制剂，但随之导致耐药性细菌产生及抗生素残留等问题，对食品安全造成重大影响，因此亟需开发新的手段来进行水体减菌和净化处理。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株具有高凝聚活性的戊糖片球菌，可用于水体中的副溶血性弧菌的减菌和净化处理，而避免使用化学抑菌剂和抗生素来进行水体减菌和净化处理，为养殖和暂养水体中的副溶血性弧菌的生物控制提供新的手段，同时有利于预防副溶血性弧菌引起的水生动物疾病和食源性疾病的传播。

本发明从发酵豆制品卤水中分离出一株戊糖片球菌F28-8（Pediococcus pentosaceus），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC No.9956，保藏日期为2014年11月13日，菌种的分类命名为戊糖片球菌，Pediococcus pentosaceus。

本发明中的戊糖片球菌F28-8具有以下生物学特性：

（1） 形态特征：戊糖片球菌F28-8革兰氏染色结果为阳性，细胞呈圆球形，成对或四联排列，无芽胞，无荚膜，无鞭毛。

（2）菌落特征：戊糖片球菌F28-8在MRS 固体培养基上生长良好，菌落形态为圆形、乳白色、光滑、凸起，边缘整齐，不透明。

（3）生理生化特征：过氧化氢酶阴性，不产生吲哚、硫化氢和氨，不还原硝酸盐，不水解精氨酸，可发酵葡萄糖，不发酵山梨糖、蜜二糖、木糖醇、蔗糖、乳糖、松三糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇；可从纤维二糖、七叶苷、藫糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、甘露糖发酵产酸。

（4）对副溶血性弧菌具有强烈的凝聚性和抑菌性。

本发明从发酵豆制品中的戊糖片球菌中分离出戊糖片球菌分离株，通过测定其对副溶血性弧菌的抑菌特性和共凝聚能力，筛选出具有高凝聚力的戊糖片球菌，并通过电镜来观察不同凝聚力的戊糖片球菌菌株的表面微观结构，测定其对水体中致病性副溶血性弧菌存活率的影响来考察其对水体中副溶血性弧菌净化效应，具体包括以下步骤：

（1）菌株复苏培养  戊糖片球菌F28-8接种5 mL MRS液体培养基，tdh基因阳性的致病性副溶血性弧菌ATCC33847接种 LBS液体培养基，备用。

（2）抑菌能力测定  用琼脂孔扩散法，通过测定戊糖片球菌菌株无细胞提取液对副溶血性弧菌在LBS固体平板上的抑菌圈的大小来检测其抑菌能力。

（3）共凝聚能力测定  调节戊糖片球菌的菌悬液的浓度，将调好浓度的戊糖片球菌悬液与相应的副溶血性弧菌菌悬液各取混合，测定吸光值，记作Amix，以未混合戊糖片球菌的副溶血性弧菌菌悬液作为对照，按照以下公式：{[(Ap+Av)/2]-Amix}/(Ap+Av)/2*100来计算细菌共凝聚率，其中Ap和Av分别为戊糖片球菌和副溶血性弧菌菌悬液在600 nm处测所测的A值。

（4）凝聚细胞的电镜观察  吸取自凝聚2 h的未混合戊糖片球菌的菌悬液样品进行扫描电镜，吸取共凝聚2 h的戊糖片球菌和副溶血性弧菌的混合菌悬液样品进行扫描电镜，分别观察细胞的结构和凝聚特征。

（5）凝聚过程中副溶血性弧菌存活细胞测定 将戊糖片球菌和副溶血性弧菌混合菌悬液在37℃混合静置培养2 h、12h、24h、60h、96h后，分别吸取样品中上层和下层溶液通过选择性TCBS琼脂平板测定体系中的细菌浓度。

本发明的有益效果是：

戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus），是乳酸菌中的一个种，广泛分布于蔬菜、干酪、香肠等传统发酵食品中，是公认的具有安全性的微生物。该菌代谢糖类产生乳酸，并产生IIa类片球菌素，对病原菌及腐败微生物产生强烈的抑制效应，其中一些菌株具有提高动物天然免疫能力、促进健康以及抵抗病原菌的侵袭等益生特性，以戊糖片球菌及其代谢产物研发新型抑菌剂和微生态制剂对食品和环境中弧菌净化控制以及弧菌病的生物防治具有潜在价值和广阔前景。