[发明专利]一种分离纯化能降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种分离纯化能够降解大豆蛋白过敏原的蛋白酶的方法，其特征在于，是从一株可降解大豆主要过敏原的芽孢杆菌发酵上清液中，依次利用硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析柱和凝胶过滤层析柱，来纯化得到蛋白酶；所述方法，具体包括：(1)硫酸铵分级沉淀：在发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末至饱和度为35-80％，离心去上清；然后再缓慢加入硫酸铵粉末至饱和度为50-85％，离心取沉淀，将沉淀的蛋白复溶；(2)透析：将上述复溶后的蛋白进行透析；(3)阴离子交换层析：将透析后的蛋白进行阴离子交换层析，初始上样缓冲液为10-100mM的缓冲液，pH 8.0-10.0，洗脱液为上样缓冲液中加入0.1-1.0mol/L NaCl，线性洗脱；(4)凝胶过滤层析：利用凝胶过滤层析柱进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述芽孢杆菌保藏中国典型培养物保藏中心，菌株保藏号为CCTCC M 2012165，分类学命名为Bacillus sp.BBE201108。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀是在0-10℃下完成的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫酸铵分级沉淀，是先添加硫酸铵粉末至饱和度为50％，离心取上清后再添加到饱和度为80％。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阴离子交换层析的初始上样缓冲液为25mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0，洗脱液为上样缓冲液中加入1mol/L NaCl，线性洗脱。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法，具体包括：

1)硫酸铵分级沉淀：于4℃下向发酵上清液中缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为50％，于4℃，7000rpm离心取上清液；向上述获得的上清液中于4℃下缓慢添加硫酸铵粉末，至饱和度为80％，于4℃，7000rpm离心取沉淀，将沉淀后的蛋白复溶；

2)透析：将上述复溶后的蛋白于4℃下进行透析，透析缓冲液为25mmol/L的Tris-HCl，pH 9.0；

3)阴离子交换层析方法，初始上样缓冲液为25mM的Tris-HCl，pH 9.0，洗脱液为上样缓冲液中加入1mol/LNaCl，线性洗脱；

4)利用凝胶过滤层析柱Superdex 75进行进一步的分离，得到了电泳纯的蛋白。

7.一种利用权利要求1所述方法得到的蛋白酶。

8.权利要求7所述蛋白酶在降解大豆蛋白过敏原方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，是将纯化后的蛋白酶与0.1-8％的大豆分离蛋白SPI溶液按照每1mL SPI溶液添加30-500U蛋白酶，于20-60℃反应5-30min。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述方法是在每1mL的1％SPI溶液中添加250U的酶。