[发明专利]采用引物关联通用探针检测多重基因或不同靶标的实时荧光PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及实时荧光PCR扩增检测方法，尤其是涉及一种采用引物关联方法，实现通用探针检测多重基因或不同靶标的实时荧光PCR方法。

背景技术

    聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术，它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍，参见美国专利第4，683，195和第4，683，202号。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。该方法的优点是实现了DNA模板的体外快速扩增放大，用于后续电泳分析鉴定，敏感度高。但该方法的问题是电泳方法鉴定，经常带来PCR产物的污染，无法在临床应用推广。

实时荧光定量PCR （Real-time PCR）技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

荧光定量PCR所使用的荧光化学可分为两种：荧光染料和荧光探针。现将其原理简述如下：

1）SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。该方法的优点是实现了闭管反应检测，实时检测产物来量，无需电泳检测，但荧光信号特异性不强，需要后续溶解曲线分析进行特异性分析。延长了分析时间，技术要求高，结果判定主观性强，临床推广受限。

2）TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。如美国专利US5,723,591报道，该方法的优点是实现了闭管反应检测，实时检测产物来量，无需电泳检测，速度快，准确性高，特异性强。但不同检测靶标必须设计和使用不同型的特异的探针，探针的合成费用比较昂贵。

多重PCR(multiplex PCR)，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物探针，同时扩增检测多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同，多重PCR主要用于多种病原微生物的同时检测或鉴定，多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，采用荧光定量PCR方法，可同时高效性、经济、简便、快捷检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染。但在单管多重扩增检测应用中，因荧光通道数有限，最多只能检测五个。单管检测6个以上靶标时，就需要2个以上靶标共用一个通道，这些靶标就需要标记对应的相同荧光染料，每条探针都有一定的本底信号，多条探针本底信号累积，就会出现本通道本底信号太高，严重影响扩增曲线线型，同时多条探针合成成本昂贵。