[发明专利]一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属生物检测技术领域，具体涉及一种检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物及试剂盒。

背景技术

梨火疫病菌(Eriwinia amylovora(Burrill)Winslow et al)是国际上的重要植物检疫对象，在我国新出台的《中华人民共和国进境植物检疫危险性病、虫、杂草名录》被列为检疫性有害生物，由该病菌引起的梨火疫病是经济作物苹果、梨、山楂等的毁灭性病害。梨火疫病最早在北美洲被发现，近几十年。随着世界贸易的发展该病随种苗、果实及包装材料迅速传播，几乎遍及整个欧洲大陆。各国对梨火疫病都十分敏感，多数国家都将其列为检疫性有害生物。近年来，为了满足国内市场的需求，我国相继从韩国、日本等地大量引进优良梨、苹果苗木及果实。因此，梨火疫病已经对我国果品生产和进出境水果贸易构成潜在威胁。梨火疫病菌可侵染蔷薇科40余属的220多种植物,给当地生物的多样性和农业带来巨大危害，也给水果贸易造成了壁垒。中国广泛存在梨火疫病的适生条件和感病寄主，其广阔的温带气候地区也是该病害的适生区，这里集中了中国主要的苹果产区，随着高感病苹果栽培品种如嘎啦、乔纳金的种植推广，该病害的入侵风险进一步增加。梨火疫病菌一般从寄主的花器侵入，然后引起枯枝和整个植株死亡,最典型的症状是花、果实和叶片受火疫病菌侵害后，很快变黑褐色枯萎，犹如火烧一般，但仍挂在树上不落，故此得名。梨火疫病远距离传播主要是感病寄主繁殖材料，包括种苗、接穗、砧木、水果、被污染的运输工具、候鸟及气流。其中最危险的传播途径是通过病接穗、苗木、果实的传带。目前国内还没有梨火疫病的发生,但梨火疫病的人为和自然传播对中国构成了潜在威胁,尤其是相邻的日本已经有梨火疫病的分布,准确灵敏的检测技术是阻止该病害传入的有效手段。

目前，国内对梨火疫病的检疫尚无检测标准。其检验方法亦很多，从经典的分离培养、致病性测定、症状观察等到先进的分子生物学技术包括DNA探针、PCR技术的应用及脂肪酸分析、单克隆抗体的应用等，但在检疫上采用较多的为免疫荧光荧光染色结合致病性测定确诊的方法，检测周期太长，不能适应进出口商品的实际需求。近年来，许多新的分子生物学研究方法也应用在梨火疫病菌的检疫上。这些方法虽然特异性高，检测周期短，但均需要PCR后处理，通常需要一至几天才能完成，另一个问题是PCR后处理常常出现污染而影响试验的准确性和可靠性

发明内容

本发明的第一目的是提供检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，第二目的是提供了一种利用该引物检测梨火疫病菌的试剂盒，从而能够实现对梨火疫病菌进行准确快速的检测，弥补现有技术的不足。

本发明一个方面涉及检测梨火疫病菌的环介导恒温扩增引物，为一对外侧引物F3、B3和一对内侧引物FIP、BIP，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1-4。

本发明另一个方面提供一种梨火疫病菌的环介导恒温扩增快速检测试剂盒，包括有如下的组分：

1)引物混合液：80μmol/L引物FIP 2μL，80μmol/L引物BIP 2μL，10μmol/L引物F32μL，10μmol/L引物B32μL；

2)环介导等温扩增混合液：8U/μL Bst DNA PoLymerase 2μL，2.5μmol/LdNTP 4μL，1×ThermoL Buffer 2.5uL，ddH₂O 31.5μL；其中1×Thermol Buffer成分为：20mmol/LTris-HCl,10mmol/LKCl,10mmol/L(NH4)₂SO4,2mmol/LMgSO4,0.01％Triton X-100；

3)梨火疫病菌阳性对照DNA 2μL。

4)荧光显色剂：成分为100×的荧光染料SYBR GREEN I。

本发明的梨火疫病菌的环介导恒温扩增(LAMP)检测试剂盒的操作方法如下：

1)待测样品中DNA模板的提取：用市售的DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待测样品中DNA。其中提取的样品DNA的纯度比值OD260/OD280在1.6-2.0范围内，核酸浓度在40-100ng/μL范围内。

2)LAMP恒温扩增：在PCR管中加入引物混合液8μL、环介导等温扩增混合液40μL、模板DNA 2μL，混合。将配制好的PCR管于61℃水浴锅中恒温反应60min，然后80℃10min终止反应，降温至4℃。