[发明专利]一种诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片

说明书

技术领域

本发明涉及免疫诊断领域，具体的说是一种运用生物信息学的方法预测引起仔猪病毒性腹泻的三种病毒膜蛋白胞外部分表位，根据表位、结构、同源性的具体特点，合成一定长度的多肽，免疫母鸡，获得灵敏度高、特异性强的三对IgY抗体，然后制备固相支持物，采用基因芯片的制作方法，通过检测三种病毒颗粒表面特定蛋白质的多少来判定病毒颗粒的数量和种类，进而快速诊断猪病毒性腹泻的蛋白芯片。

背景技术

猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，PED)是猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪肠道传染性疾病。目前其在临床上与猪传染性胃肠炎(transmissible gastroenteritisvirus，TGEV)和猪轮状病毒(porcine rotavirus，PRV)腹泻共存混合感染，给该病的防控和研究带来极大的不利。猪流行性腹泻仅发生在猪上，各种年龄的猪都能感染。本病多发于寒冷季节。春秋季节也有小规模流行发生。哺乳仔猪、架子猪和育肥猪的发病率高达100％，尤以对哺乳仔猪的危害最为严重。成年母猪发病率为70％-90％。虽然PED首次在欧洲发生，但是目前已经成为包括中国、韩国、日本、菲律宾以及泰国等亚洲国家猪产业中严重的传染性疾病，造成了巨大的经济损失。我国目前猪流行性腹泻的发病率仍呈逐年上升趋势。爆发该病时无特效抗病毒药物可以使用。故早期风险评估诊断对于防控的作用就显得非常重要。

随免疫学的不断发展，运用各种新的免疫技术，如化学发光技术、时间分辨荧光免疫测定技术、荧光偏振免疫分析测定技术等进行自动化免疫分析的仪器不断涌现。它们不仅提高了工作人员的效率，还大大提高了检测的准确度和灵敏度，其中有的灵敏度可达ng甚至pg级水平。

鸡卵黄抗体是从鸡蛋的蛋黄中分离得到的免疫球蛋白，相比别的免疫球蛋白，鸡免疫球蛋白具有更好的稳定性，加上鸡免疫球蛋白来之于鸡蛋的蛋黄，产量非常丰富，还增加了生物安全性，且提纯工艺简单，还具有一定的动物福利。同时母鸡与哺乳动物亲缘关系较远，也不结合类风湿因子。减少了在免疫检测中假阳性反应机会。种种优势，使得鸡免疫球蛋白在检测诊断产品中的应用具有很大的市场价值。

蛋白质芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，可用于蛋白质表达谱分析，研究蛋白质与蛋白质的相互作用，甚至DNA-蛋白质、RNA-蛋白质的相互作用，筛选药物作用的蛋白靶点等，蛋白芯片能同时在同一个样本中对多个细胞因子进行分析，对全面分析治病因子，给疾病的诊断和治疗是很有价值。也是时下诊断产品应用中的热点。

发明内容

本发明目的即在于提供一种快速、廉价、全面的诊断猪病毒性腹泻的免疫化学发光蛋白芯片。

本发明涉及一种新型诊断猪病毒性腹泻的免疫化学发光蛋白芯片。通过合成针对三种病毒(PDEV/TGEV/PRV)膜蛋白(M蛋白，S蛋白)胞外表位的多肽，进行免疫母鸡，每一种病毒都筛选出一对特异性强，灵敏度高的IgY抗体。然后制备固相支持物，将琼脂糖铺在经过处理的玻片上，进行环氧化和羧基化处理，让琼脂糖连接羧基(COOH)，再与2-巯基乙醇反应，获得只结合IgY的固相支持物，待与每种病毒一对抗体中其中一个IgY抗体孵育后，IgY抗体会结合在这个固相支持物上，当结合有IgY的固相支持物与待检样品反应，样品中的大部分病毒颗粒被特异性的结合。加入一对抗体中的另外一个IgY抗体，加入碱性磷酸酶标记的二抗，经温育后形成固相包被抗体-抗原-抗体-酶标记二抗复合物。洗涤、分离后加入底物AMPPD作为化学发光剂，AMPPD在碱性磷酸酶的催化作用下，迅速去磷酸，生产中介体AMPD。AMPD很快分解，从高能激发状态，回到低能量的稳定态，同时发射光子，这种发光稳定、持续时间可长达1小时。通过光量子阅读系统记录发光强度，并从标准曲线上计算出待测样品中病毒颗粒的数量。

本发明首次采用只结合IgY抗体的固相支持物作为反应平台，也首次采用三种病毒(PDEV/TGEV/PRV)膜蛋白(M蛋白、S蛋白)胞外表位的多肽，免疫母鸡，每种病毒都获得一对灵敏度和特异性强的抗体，还首次将这三种病毒的检测放在一个反应体系中，组成一个蛋白芯片。

本发明包括以下步骤：1.多肽位置和长度的选择；2.母鸡的免疫；3.抗体的纯化和筛选；4.固相支持物的制备；5.酶标二抗的制备。

具体实施方式

本发明的内容，通过以下的实施例作具体说明：

实施例：

1.多肽位置和长度的选择