[发明专利]一种天然二硫键与阿魏酸酯酶A功能相关性的验证方法

权利要求书

1.一种改造后的源自宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)E001的阿魏酸酯酶A基因AufaeA^C29T、AufaeA^C91T和AufaeA^C234T，其对应的核苷酸和蛋白质序列分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

2.突变阿魏酸酯酶A工程菌的构建和表达方法：

(1)突变残基位点的选定：以黑曲霉阿魏酸酯酶A的三维结构(1UWC)为模板，用Modeller 9.9软件模拟出AuFaeA的三维结构。由其三维结构观察天然二硫键的位置确定突变氨基酸位点以打断单一天然二硫键；

(2)突变基因AufaeA^C29T、AufaeA^C91T和AufaeA^C234T及其表达质粒的构建：根据已申请发明专利(申请号：201210181372.X)中核苷酸序列及突变位点特点设计突变引物C29T-R，C91T-R，C234T-F：

C29T-R：5’-AGTCGATGGAATATTAGTTAGGTCGGCGT-3’，

C91T-R：5’-CGCAATCGTTAGTTTGAGGTAGAGT-3’，

C234T-F：5’-ACTGGGGATGAACTACAGACTTGTGAGGCA-3’，

C29T单突变：以本实验室保存的pUCm-T-AufaeA为模板(申请号：201210181372.X)，用已申请发明专利(申请号：201210181372.X)中特异性引物FAE-F和C29T-R进行第一轮PCR，获得基因片段AufaeA²⁹；以pUCm-T-AufaeA为模板，以第一轮PCR产物AufaeA²⁹为引物与已申请发明专利(申请号：201210181372.X)中特异性引物FAE-R进行第二轮大引物PCR；

C91T单突变：以pUCm-T-AufaeA为模板，用引物FAE-F和C91T-R进行第一轮PCR，获得基因片段AufaeA⁹¹；以pUCm-T-AufaeA为模板，以第一轮PCR产物AufaeA⁹¹为引物与FAE-R进行第二轮大引物PCR；

C234T单突变：以pUCm-T-AufaeA为模板，用引物C234T-F和FAE-R进行第一轮PCR，获得基因片段AufaeA²³⁴；以pUCm-T-AufaeA为模板，以第一轮PCR产物AufaeA²³⁴为引物与FAE-F进行第二轮大引物PCR；

分别将三个单突变的第二轮PCR产物(AufaeA^C29T、AufaeA^C91T和AufaeA^C234T)用1％琼脂糖凝胶电泳分析，割胶回收目的条带并与pUCm-T连接(pUCm-T-AufaeA^C29T、-AufaeA^C91T、-AufaeA^C234T)。转化JM109，经酶切鉴定正确后送上海生工测序；

(3)重组表达质粒的构建：将测序结果正确的pUCm-T-AufaeA^C29T、-AufaeA^C91T、-AufaeA^C234T和pPIC9K质粒均用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组表达质粒pPIC9K-AufaeA^C29T、-AufaeA^C91T、-AufaeA^C234T，并对重组表达质粒进行序列测定；

(4)GS115/AufaeA^C29T、/AufaeA^C91T、/AufaeA^C234T重组子的构建、表达及酶学特性的测定：用SalⅠ对pPIC9K-AufaeA^C29T、-AufaeA^C91T、-AufaeA^C234T进行线性化，按照毕赤酵母表达手册进行电转化、筛选，得到高拷贝的毕赤酵母重组子GS115/AufaeA^C29T。该工程菌用1.0％甲醇诱导72h。离心上清液为重组阿魏酸酯酶A粗酶液，它们的酶活性分别为0.84、0.42和0.45U/mL，经SDS-PAGE检测均为单一条带，改造后重组AuFaeA^C29T、AuFaeA^C91T和AuFaeA^C234T的最适反应温度为25、25和35℃。突变酶的酶活性和最适温度较原酶(11.03U/mL、45℃)都大幅下降。