[发明专利]从橡胶树叶片中分离筛选拮抗细菌的方法

权利要求书

1.一种从橡胶树叶片中分离筛选拮抗细菌的方法，包括以下步骤：

(1)采集橡胶感病叶片；

(2)用升汞浸泡叶片，然后用无菌水冲洗；

(3)将叶片放在PDA培养基上，28℃培养48h后将长出的菌体转接至相同的培养基上，28℃培养48h后纯化；同时，将纯化后所得的细菌采用梯度稀释涂布LB培养基中，28℃培养48h后挑取单菌落接至相应培养基斜面上；

(4)将单菌落28℃震荡培养约12小时，吸取少量置于LB固体培养基上，涂抹均匀，28℃培养；然后通过无限稀释法处理获得单一菌株；

(5)从菌株中筛选出细菌，转接到LB平板，用涂布平板法得到单菌落；对获得的单菌株与供试菌橡胶树炭疽菌RC178进行对峙培养；

(6)通过观察有无抑菌圈，挑选出现抑菌圈的拮抗细菌。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述PDA培养基配方为：马铃薯200g/L、葡萄糖或蔗糖10g/L、琼脂18g/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述LB培养基配方为：胰蛋白胨10g/L、酵母浸出粉5g/L、NaCl 10g/L，pH＝7；在上述配方中加入琼脂形成LB固体培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(4)的震荡培养为：将放置于8～10℃培养箱中的斜面试管取出，在无菌操作台中，将液体LB培养基分装到锥形瓶中，然后用接种针挑去少量的细菌于锥形瓶中，封口；放置于28℃摇床上震荡培养约12小时，取出。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其中所述步骤(5)的对峙培养为：用涂布平板法得到单菌落，供试菌株RC178用无菌打孔器打取直径为6mm的菌饼，置于直径为90mm的平板中间，在围绕RC178十字交叉的4个角落分别接种经过初筛的多个菌株，每个菌株3个重复，用保鲜膜封上培养皿以防污染；采用点线处理法和其他对峙形式，进行对峙培养；以只接病原菌，不接分离菌株为对照。