[发明专利]抗衰老短肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域重组蛋白的设计和制备方法，具体是一种新型抗衰老短肽及其制备方法。

背景技术

人和高等动物的皮肤由表皮、真皮、皮下组织组成。表皮没有血管，细胞的能量和营养必须由真皮微循环提供。真皮层是皮肤的生命源泉，是一层致密、坚韧且有弹性的组织，主要由纤维成分（胶原蛋白纤维、弹力纤维和网状纤维）、糖蛋白、氨基葡萄糖和玻尿酸等组成。玻尿酸是一种透明的胶状物质，吸水能力可达 500-1000倍，是公认的最佳保湿产品。年轻的皮肤，玻尿酸含量高，皮肤光滑、弹性、水嫩、膨胀饱满；皮肤老化时，真皮层变薄，减少了真皮层与表皮层之间物质交换的界面，细胞的正常代谢和有丝分裂作用受到阻碍，皮肤萎缩产生皱纹，因此抗衰老要从补充真皮层营养物质（如胶原蛋白和玻尿酸等）开始。胶原蛋白可以弥补基底膜功能，帮助表皮层与真皮层的结合，能够将水分、养分保送至真皮层。因此，如果能够补充人体皮肤中的胶原蛋白，将能够有效地对抗皮肤衰老的问题。

棕榈酸五胜肽-3（Pentapeptide-3）别名五环短肽或五胜月肽，它是由法国著名化妆品公司Sederma公司研发出品的一种人工合成的短肽。它能够有效促进透明质酸、胶原蛋白和弹力纤维增生，减少肌肤细纹，提高肌肤的含水量，增加皮肤厚度，增强肌肤紧致感和光泽度。它是胶原蛋白I（Collagen I）碎片与棕榈酸（Palmitic Acid）结合后得到的对皮肤更具亲和性和亲水、锁水性的物质。研究表明，若将棕榈酸五胜肽-3加入纤维组织母细胞培养皿中，能加强胶原蛋白I、VII（纤维胶原)和纤维黏连蛋白的合成能力，还能促进表皮内的纤维母细胞产生胶原蛋白和玻尿酸等重要成分。可见，棕榈酸五胜肽-3对减轻皮肤老化有重要作用。试管内测试表明，棕榈酸五胜肽-3能迅速激活胶原蛋白IV合成能力达到100%～327%，激活玻尿酸的合成能力达到267%。如今，该短肽已经广泛应用于许多知名品牌的化妆品行列。

目前，已经有很多国家的知名化妆品品牌的许多系列添加了棕榈酸五肽-3作为抗衰老的营养成分。我国上海和深圳的一些生物科技公司也有该产品销售。但是，目前棕榈酸五胜肽-3的制备方法还都是局限于化学合成，其高额的成本限制了这类产品的广泛使用。因此，为了能使这类短肽类的皮肤营养产品不断走近百姓的日常生活，使得普通人拥有安全、稳定、实用的高品质化妆品，有必要设计研发更加高效的抗衰老短肽，并探索大规模制备抗衰老短肽的技术。

发明内容

本发明为了提高现有抗衰老短肽—棕榈酸五肽-3的生物学活性，同时降低这类美容肽的生产成本，提供了一种新型抗衰老短肽的设计方案，并提供其大规模的制备方法。

本发明是采用如下技术方案实现的：

一种抗衰老短肽，由13个氨基酸所组成，其氨基酸序列为：Gly-Pro-Lys-Thr-Thr- Lys-Ser-Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln，用单字符号表示为GPKTTKSLEVLFQ。

上述G13短肽可以通过多种生产工艺进行制备：

1、利用大肠杆菌发酵的工艺，重组表达制备的G13，简称rG13，生产工艺简单，成本低廉，易于推广。

2、利用化学合成的工艺合成G13，简称sG13，成本较高，但是具有与rG13类似的生物学功能。

本发明提供上述的抗衰老短肽的制备方法，包括如下步骤：

（1）、大肠杆菌基因工程菌的构建

1.1、设计Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser（用单字符号表示为LEVLFQGPKTTKS）氨基酸序列为基本重复单元L13构建蛋白序列pL13-n，其中n为1-100的任意数值；

1.2、合成如上所示蛋白序列相对应的核苷酸序列nL13，（ctggaagtgctgtttcagggcccgaagaccaccaagagc）_n；

1.3、将核苷酸序列nL13克隆进入表达载体，然后将表达载体转入大肠杆菌表达菌株中，筛选得到大肠杆菌基因工程菌；

（2）大肠杆菌基因工程菌的发酵培养

2.1、挑取优选后的大肠杆菌基因工程菌单菌落，至于LB培养基中35～38℃培养过夜；

2.2、将菌液接种放大培养，35～38℃培养2.5～3小时，加入IPTG进行诱导，15～18℃继续培养18～22小时，此时表达出的蛋白为GST-pL13-n，离心收集菌体；

（3）重组抗衰老短肽rG13的纯化