[发明专利]选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法

权利要求书

1.一种选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-101；

2)、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，命名为干酪乳杆菌LcS-Met^-；

3)将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-101和干酪乳杆菌LcS-Met^-共发酵鲜羊乳，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳。

2.根据权利要求1所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制备2个平板豆芽汁鲜羊乳固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B；②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。

3.根据权利要求2所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁鲜羊乳固体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

4.根据权利要求1所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D；②将诱变后的干酪乳杆菌涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌。

5.根据权利要求4所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的平板MRS固体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

该MRS固体培养基的pH值保持在6.2～6.4。

6.根据权利要求1所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤3)中，在共发酵之前，将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-101和干酪乳杆菌LcS-Met^-分别进行活化培养，纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-101在豆芽汁鲜羊乳液体培养基中进行活化培养，培养温度为34～36℃，干酪乳杆菌LcS-Met^-在MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为36～38℃。

7.根据权利要求6所述的选育干酪乳杆菌与纳豆芽孢杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的发酵羊乳的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的豆芽汁鲜羊乳液体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

鲜羊乳           100～150mL；

蔗糖              4.0～6.0g；

豆芽汁                 余量；

所述的MRS液体培养基以1L计，由以下量的组分组成：

该MRS液体培养基的pH值保持在6.2～6.4。