[发明专利]一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

间 充 质 干 细 胞 （ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）是目前倍受关注的一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可来源于多种组织，如骨髓、脂肪、脐带等，最近资料表明，人脐带间充质干细胞（ｈｕ-ｍａｎｕｍｂｉｌｉｃａｌｃｏｒｄｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ｈＵＣＭ-ＳＣｓ）存在于新生儿脐带中，富含于羊膜被覆上皮与脐 带 血 管 之 间 的 华 通 胶 （即 Ｗｈａｒｔｏｎｊｅｌｌｙ）内，脐带属于废弃物，取材方便，且无伦理学限制，从脐带内提取干细胞成本较低。ｈＵＣＭＳＣｓ具有 ＭＳＣｓ的一般特性：处于未分化状态，表达间充质干细胞膜标记分子，不表达或低表达造血干细胞标记分子；体外可向成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、内皮细胞等方向分化，ｈＵＭＳＣｓ具有高增殖性、低免疫原性、细胞替代治疗效果显著等特点，已被广泛地应用于临床基因和细胞治疗中，尽管如此，ｈＵＣＭＳＣｓ基础方面的研究仍然面临较多问题。

发明内容

本发明的目的是：提供一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方法采用组织块植入法获得的ｈＵＣＭＳＣｓ具有较强的增殖能力，在体外诱导培养下可向成骨和成脂细胞分化，以克服现有技术的不足。

本发明的技术方案

一种人脐带间充质干细胞的分离培养及超微结构特点研究方法，该方法采用组织块植入法培养原代 ｈＵＣＭＳＣｓ，绘制细胞生长曲线，根据细胞生长状态选第 ３代 ｈＵＣＭＳＣｓ进行实验，流式细胞术、透射电镜和免疫细胞化学等技术研究 ｈＵＣＭＳＣｓ的生物学特性。

由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明所培养的细胞基本符合ＭＳＣｓ委员会制定的鉴定 ＭＳＣｓ的标准，可确认为人脐带间充质干细胞，这一结果将为后续试验提供具有较强增殖能力及诱导分化潜能的种子细胞。

附图说明

附图1为ｈＵＣＭＳＣｓ生长曲线图。

具体实施方式

下面对本发明进一步的详细说明，但不作为对本发明的任何限制。

本发明的实施例：

１　材料与方法

１．１　实验材料

足月剖腹产手术的健康胎儿脐带组织（家属知情同意，贵阳医学院附属医院产科提供）。脐带采集之前产妇需做艾滋病病毒抗体、乙型肝炎病毒抗体、丙型肝炎病毒抗体、梅毒螺旋体抗体、支原体等病原检测。脐带采集后 ４℃保存，在 ６ｈ内完成组织分离处理。

１．２　ｈＵＣＭＳＣｓ的体外培养

预冷 ＰＢＳ反复冲洗脐带后，将其剪成约 ２ｃｍ长的小段，剔除脐静脉内膜、脐动脉和脐带外膜后，剪成约 １ｍｍ^３大小的组织块，用钩针将组织块点兵式间距 １ｃｍ摆放于 ５０ｍｌ培养瓶底壁（培养基预湿润），将培养瓶底壁朝上置入 ＣＯ２培养箱中，３７℃、５％ ＣＯ２以及饱和湿度下进行培养；次日翻转培养瓶，每隔２４ｈ加入１ｍｌＤＭＥＭＦ１２培养基；３ｄ后换液，以后每３ｄ换液１次，待细胞长到８０％融合时弃去组织块，０２５％的胰蛋白酶（约 ５ｍｉｎ）消化收集贴壁细胞并进行传代培养。

１．３　ｈＵＣＭＳＣｓ的形态学观察及生长曲线绘制

取生长状态良好的第 ３、５、６代 ｈＵＣＭＳＣｓ，待细胞生长到 ８０％ ～９０％汇合时，０２５％胰蛋白酶消化收获细胞，以每孔 ５×１０^５细胞的密度将细胞接种六孔板中，常规培养细胞。接种后，每天取各代细胞（各 ４孔）进行计数，连续计数 ７ｄ，并绘制细胞生长曲线。

１４　ｈＵＣＭＳＣｓ的透射电镜观察

取生长状态良好的第 ３代 ｈＵＭＳＣｓ，预冷的２％戊二醛于 ４℃固定 ２ｈ２次，１％锇酸于 ４℃固定 ２ｈ后，５０％ ～１００％丙酮酸逐级脱水，ＥＰＯＮ８１２包埋剂包埋，醋酸铀和枸橼酸铅染色，ＰＢＳ洗涤后滤纸吸干，透射电镜（ＪＥＯＬ，日本）下观察并照相。