[发明专利]一种检测溶菌酶的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及脱氧核糖核酸（以下简称“DNA”）循环放大技术，具体地说是基于DNA循环放大技术对溶菌酶进行免疫分析检测的试剂盒及测试方法。

背景技术

溶菌酶又称为N-乙酰胞壁质聚糖水解酶或胞壁质酶，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过水解革兰氏阳性菌的细胞壁中的胞壁脂多糖而破坏细胞壁，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。并且，溶菌酶可以与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，溶菌酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。该酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的唾液、泪液、气管等分泌物中。溶菌酶是多种动物组织的内源性免疫系统的重要组成部分，而且在不同组织处其正常含量也各不相同。很多组织中的溶菌酶含量的变化通常会与某些疾病相关联。例如，血液的尿液中溶菌酶浓度异常意味着血液或肾脏方面的疾病；新生儿体内溶菌酶缺乏可能会导致支气管性肺发育障碍；食谱中溶菌酶缺乏可能会增加患痢疾病的发生。因此，对体内溶菌酶的检测在对很多疾病诊断中起着非常重要的作用。

DNA循环放大技术是很多免疫检测中经常用到的方法之一，通常包括等温扩增、滚环复制、杂交链式反应。由于自身信号放大，DNA循环放大技术具有消耗样品量少、快速、灵敏的优势，近年来被广泛应用于DNA、细胞、生物分子和胚胎的检测。将多个反应设计成可以自发循环的过程，从而能够将信号多次放大，这将会有效提高对目标物的检测限同时减少对样品的消耗量。基于此，选择设计合适的信号探针、引物、聚合酶是关键。自从1992年Fleming发现溶菌酶以来，对体内溶菌酶的检测一直在不断的开展，并取得了一定的进展。然而，操作简单、具有高特异性、高灵敏性的溶菌酶检测方法仍然是研究者所关注并不断追求的。

本发明的试剂盒设计成以溶菌酶的适体识别引发，通过DNA杂交、DNA链（靶）替换、聚合反应循环实现对信号的放大，进而实现对溶菌酶高灵敏和高特异选择性的检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测溶菌酶的试剂盒，该试剂盒操作程序简单、灵敏度高、特异选择性好，适用于尿液、人体血清中溶菌酶的快速检测。

本发明中试剂盒的组成为：两条信号探针、一条引物、聚合酶Klenow、缓冲液NEBuffer。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1、  合成探针1：设计三条寡聚脱氧核糖核苷酸序列（S1，S2，S3），S1为含有溶菌酶适体序列并修饰四甲基罗丹明荧光基团；S2为一端修饰氨基，便于与磁珠结合，并且其序列部分可以与S1和S3互补；S3则为与S2部分互补的序列。三条寡聚核糖核苷酸序列通过杂交结合在一起，并通过S2上的氨基与羧基修饰的磁珠结合从而形成了信号探针1。

2、  合成探针2：设计两条寡聚脱氧核糖核苷酸序列（S4、S5），S4为一端修饰氨基的发卡结构，便于与磁珠结合；S5为一端修饰四甲基罗丹明荧光基团并且其序列能够与S4的茎序列互补。两条寡聚核糖核苷酸序列通过杂交结合在一起，并通过S4上的氨基与羧基修饰的磁珠结合从而形成了信号探针2。

3、  溶菌酶检测：把溶菌酶，引物（S6）加入到上述合成的探针中，首先溶菌酶通过与其适体互补杂交引发；探针1中S1与S2杂交作用被破坏，部分序列片段被暴露出来；通过引物，在聚合酶和dNTP作用下引发DNA聚合反应，反应延伸的新链将溶菌酶与S1的复合体以及S3替换下来，释放到溶液中；在聚合酶和dNTP作用下引发第二个聚合反应，此时溶菌酶被释放下来，可以进入下一个反应形成一个循环。替换下来的S3遇到信号探针2，通过杂交结合在一起；在引物、聚合酶和dNTP作用下引发聚合反应，S3再次被释放到溶液中，进入下一个反应形成另一个循环。

4、  荧光强度测试：取上述反应后的上清液稀释后进行荧光测试。

本发明的主要创新性和优越性为：

1、  本发明采用“一锅煮”的方法，实验操作简单。

2、  本发明以溶菌酶适体识别引发，可以高特异选择性的检测溶菌酶。

3、  通过两个DNA循环放大荧光信号，可以高灵敏的检测溶菌酶。

附图说明

图1为本发明用于荧光检测溶菌酶的示意图。

图2 A为荧光响应曲线；B为工作曲线。

具体实施方式