[发明专利]利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法

说明书

技术领域

本发明属于食品质量控制检测方法领域，具体涉及用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的引物组，以及含有该引物组的检测试剂盒，还涉及利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛肉源成分的方法。

背景技术

肉制品是人体蛋白质的重要来源。不同动物源的肉品质、价格上存在较大差异，由于利益的驱动，不法商人肉掺假现象时有发生，严重损害消费者利益，也带来食品安全问题。对动物源性成分进行现场检测，是解决肉掺假市场监管问题的有效方法。

牛肉相对于鼠肉和兔肉价格较高，是被掺假的对象之一。目前，对于牛肉源成分的区分和鉴定主要是利用核酸序列的特异性，即利用核酸扩增技术。常规PCR检测和荧光定量PCR检测是应用最广的核酸扩增技术，但是PCR技术需要PCR仪或荧光定量PCR仪，主要适合在实验室，而不利于在基层实验室推广应用等(罗家琴等,中国农业科学.2008,41(7):2112-2119；Kaur J等.2010,21(11):1536–1544.doi:10.1016/j.foodcont.2010.03)。

动物种源的定性检测要求所建立的体系具有较高的灵敏度，进而可检测到样品中某种动物源的存在与否。因此，目前的定性检测研究多将目的片段定位于多拷贝基因，例如线粒体基因，多数细胞皆含大量线粒体，且每个线粒体中含数拷贝线粒体DNA，从而可使检测限达到较低水平，提高灵敏度。分析比对鼠、牛、羊上的线粒体基因组序列，本发明选用具有牛属代表性的线粒体基因组中的ATP8基因作为检测牛属的目标核酸序列。

交叉引物恒温扩增技术(Crossing Priming Isothermal Amplification，CPA)(专利号为：ZL200810134583.1)是杭州优思达生物技术公司结合了恒温核酸扩增技术和核酸试纸条快速检测技术而发明的一种操作简单、时间短、成本低的检测技术，已广泛用于病原体检测等领域。该技术还具有特异性强、灵敏度高的特点，特别适合用于现场检测。目前该技术结合胶体金核酸试纸条的检测方法已被用在诸如沙门氏菌、肠出血性大肠杆菌、结核分歧杆菌、恶性疟疾、霍乱弧菌、志贺氏菌、瓜果类斑病菌等病原菌的检测(祁军等.食品研究开发，2013,34(2):67-70；祁军等.中国媒介生物学及控制杂志，2013,24(3):204-207)。

经检索，没有发现交叉引物恒温扩增技术用于动物肉源检测方面的报道。

发明内容

针对目前动物源成分检测中存在的需要专门仪器设备和专门技术人才、检测方法复杂和检测速度慢等问题，本发明目的在于提供用于交叉引物和双探针恒温扩增核酸序列检测牛源性成分的引物组。

本发明另一目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的试剂盒。

本发明第三目的在于提供利用交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的方法。

实现本发明的技术方案如下：

本发明用于交叉引物和双探针恒温扩增检测牛源性成分的引物组，由一对外围引物、一对交叉引物和一对检测探针引物组成；

其中所述的一对外围引物为：

正向外围引物BOS4s：5’-CGATAAGGGCTACGAGAGG-3’(SEQ ID No:1)，

反向外围引物BOS5a：5’-AGATCATTGTCAGTCATGTTG-3’(SEQ ID No:2)，

所述的交叉引物为：

正向交叉引物BOS2a1s：

5’-TGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGATTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTG-3’(SEQ ID No:3)，

反向交叉引物BOS1s2a：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:4)，

所述一对检测探针引物为：

检测探针引物BOS1s2a*：

5’-TTGTTGGTGTCAGTTCTGGATTGTGGGAAAAATAGTAGAAAGTTGA-3’(SEQ ID No:5)，

检测探针引物BOSHP*：5’-ATTTCCAACACAAAACT-3’(SEQ ID No:6)；

其中BOS1s2a*的5’端标记修饰生物素，BOSHP*的5’端标记修饰荧光素FAM。