[发明专利]核酸适体修饰的磁性氧化石墨烯复合材料及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及核酸适体用于蛋白的选择性亲和富集，具体地说是一种核酸适体修饰的磁性氧化石墨烯复合材料的制备及其用于目标蛋白的高效高选择性亲和富集。

背景技术

核酸适体(Aptamer，又称适配体，适配子)是能高亲和性、高特异性地结合靶标的单链寡核苷酸(ssDNA or ssRNA)，通常通过配体指数富集系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment，SELEX)筛选获得。核酸适体借助范德华力、氢键、π-π堆积、疏水作用等分子间作用力形成特殊的三维结构，从而特异地识别靶标。筛选得到核酸适体具有亲和性好、选择性高、性质稳定、易于化学修饰等诸多优点，目前已报道的核酸适体靶标包括金属离子、小分子、多肽、蛋白质、细胞，应用领域广阔。

氧化石墨烯由于其优异的物化性质，在生物分析领域受到越来越广泛的关注。氧化石墨烯不仅具有比表面积大，同时表面还含有大量含氧基团，例如羟基、环氧和羧基，易于化学修饰和亲水改性。这些优点使得氧化石墨烯成为金属和金属氧化物的理想载体(Journal of Chromatography A,2012,1254,8-13；Nanoscale 2014,6,5616–5619)，并广泛应用于生物分析领域。

发明内容

核酸适体是单链的寡核苷酸(ssDNA or ssRNA)，能够形成特殊的三维结构，对靶标具有高选择性和高特异性，并且化学稳定性高，易于化学修饰。将核酸适体作为亲和配体固载在磁性氧化石墨烯复合材料中，可降低非特异性吸附，提高富集的选择性。本发明的目的是通过提高氧化石墨烯表面羧基的含量，提供了更多的核酸适体结合位点，从而制备非特异性吸附小、富集效率高、易于操作的磁性氧化石墨烯复合材料，用于蛋白质的高选择性和高特异性富集。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

采用氨基修饰的氮三乙酸(NH₂-NTA)与氧化石墨烯上的环氧基团进行开环反应，提高羧基的含量，从而为后续的修饰提供更多的反应位点。活化羧基后，与氨基修饰的磁球进行反应，得到磁性氧化石墨烯(GO/NH₂-NTA/Fe₃O₄)。再以磁性氧化石墨烯作为载体，聚乙烯亚胺(PEI)作为还原剂和稳定剂，在其表面原位生成和固定纳米金颗粒，进一步在纳米金颗粒表面共价结合巯基修饰的核酸适体。

所述核酸适体修饰的磁性氧化石墨烯复合材料的制备，具体步骤如下：

(1)磁性氧化石墨烯的制备：将GO的水溶液超声3h，使GO彻底剥离形成均匀溶液。然后加入NH₂-NTA和强碱，使NH₂-NTA和与GO在强碱条件下进行环氧开环反应，离心去除未反应的NH₂-NTA。加入吗啡乙磺酸，调节pH 5-6。然后加入1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)作为活化试剂，超声活化羧基1-3h，活化反应完成后加入氨基四氧化三铁，超声反应1-2h，制备磁性氧化石墨烯(GO/NH₂-NTA/Fe₃O₄)；

其中，按质量比计，NH₂-NTA与GO的投料比为5:1-1:5；NH₂-NTA和强碱的投料比1:1-1:5；GO与EDC的投料比为1:10-1:20；EDC与NHS的投料比为1.5:1-1:1；GO与Fe₃O₄的投料比为1:1-1:5。

(2)制备磁性氧化石墨烯复合材料：向磁性氧化石墨烯中加入PEI，剧烈震荡1-10h。磁性吸附，去除未反应的PEI后，重新分散在水中，加入氯金酸，混合均匀，在60-95℃的水浴中反应1-4h。磁性吸附，用去离子水洗三次，制得磁性氧化石墨烯复合材料；

其中，按质量比计，磁性氧化石墨烯与PEI的投料比为1:10-1:40；磁性氧化石墨烯与氯金酸的投料比为25:1-2:1。

(3)固载核酸适体的磁性氧化石墨烯复合材料的制备：向0.1mg磁性氧化石墨烯复合材料中加入0.1-0.5mL含巯基修饰的核酸适体的pH＝7.2-8.0的Tris-HCl缓冲溶液，室温下反应1-48h。