[发明专利]一种利用重组钝齿棒杆菌生产黑色素的方法

说明书

技术领域

一株产酪氨酸酶的重组钝齿棒杆菌的构建及其在黑色素生成中的应用，本发明属于基因工程和酶工程领域。具体涉及一种酪氨酸酶基因工程菌的构建及其应用于黑色素的生物转化。

技术背景

黑色素广泛存在于动物、植物和微生物中。它在工业和农业上广泛应用，可以作为防晒霜，天然染发剂成分，阳离子的螯合剂，非晶态半导体和生物农药的光保护剂。此外，在医学领域的应用于清除自由基，抗辐射，防止磷脂脂质体的氧化，也用于治疗黑色素缺乏的一些相关疾病。然而许多合成色素对人体有一定的危害，有的甚至会致癌，因此天然黑色素的安全性越来越受到人们的关注。

目前，黑色素有从黑玉米，黑木耳，乌骨鸡等动植物中提取，从动物或植物中提取的黑色素，虽然没有对人体的危害，但由于繁琐的生产成本较高，不能大规模生产。微生物资源非常丰富，利用微生物发酵产黑色素有巨大的优势，生产工艺简单，操作方便，此外，由微生物产生的黑色素无毒，无害，稳定性更好。酪氨酸酶是(E.C.1.14.18.1)是黑色素合成过程中的关键酶。酪氨酸酶是一种含铜酶，具有单酚和双酚活性的酶，催化L-酪氨酸经过左旋多巴(L-二羟基苯丙氨酸)合成多巴醌，然后经过一系列的自然氧化，最后生成黑色素。目前国内外研究表明某些细菌具有生产黑色素的能力，主要包括弧菌属，根瘤菌，链霉菌和大肠杆菌工程菌株等。

本发明首次报道了来自于本实验室筛选到的一株被命名Streptomyces kathirae SC-1的菌株的酪氨酸酶基因，通过质粒pXMJ19，实现了在钝齿棒状杆菌SYPA 5-5中的表达，并且在本实验室已经研究了酶学性质的基础上，以酪氨酸为底物进行生物转化生成黑色素，产量达到3.49g/l。钝齿棒状杆菌作为安全稳定的工业生产菌株，发酵周期短，在医药等领域具有潜在的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供：一株产酪氨酸酶重组钝齿棒杆菌的构建及其黑色素的生物转化。

本发明的主要研究内容：本发明利用分子技术克隆了来自Streptomyces kathirae SC-1的酪氨酸酶基因(melC1C2)，构建重组表达载体pXMJ19-melC1C2，并将其电击转化到C.crenatum SYPA5-5，成功构建了基因工程菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2。对构建的基因工程菌进行酶活测定，发现重组菌的酪氨酸酶活为61.5U/ml，而原始菌株C.crenatum SYPA5-5没有酶活。本发明首次将重组钝齿棒杆菌应用于黑色素的生产。

具体实施方式

实施例1：目的基因的扩增及重组钝齿棒杆菌的构建

质粒pXMJ19-melC1C2构建具体过程如下：

首先，以菌株Streptomyces kathirae SC-1的染色体DNA为模板，利用引物P1和P2，通过PCR技术扩增得到一段1230bp大小的核苷酸序列如SEQ所示的melC1C2基因，先与pMD18-T vector连接，获得该基因的大量克隆，使用氨苄青霉素抗性平板筛选重组菌，重组质粒经BamHI/KpnI酶切释放出大小为2.7kb和1.2kb的基因条带，表明重组质粒构建成功。质粒pMD18-T-melC1C2和pXMJ19经BamHI/KpnI双酶切，胶回收纯化，T4DNA连接酶过夜连接两片段，过夜后将连接物热击转化E.coli JM109感受态细胞，使用氯霉素抗性平板筛选阳性转化子。提取转化子质粒，重组质粒经BamHI/KpnI双酶切后后释放出大小为6.6kb和1.2kb的基因片段，表明该重组质粒pXMJ19-melC1C2构建成功。将经验证构建成功的重组质粒pXMJ19-melC1C2用电击转化法转化至钝齿棒杆菌。挑取在具有氯霉素抗生素压力平板上长出的菌落，摇瓶发酵，提取质粒进行酶切验证，结果表明重组钝齿棒杆菌C.crenatum SYPA5-5/pXMJ19-melC1C2构建成功。对原始菌以及重组菌胞内蛋白表达分析可以看出，基因melC1C2在重组菌中成功实现表达。

以Streptomyces kathirae SC-1的染色体DNA为模板，设计两条引物，PCR扩增引物设计如下：

P1：5’-ATTCGCGGATCCAAAGGAGG-3’(BamHI)

P2：5’-ACGTCTGAGGTACCCCGAATC-3’(KpnI)

实施例2：

重组菌株酶活测定