[发明专利]一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法

说明书

本发明提供了一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。首先将间充质干细胞包埋在氯化钙溶液条件下制备的、含有明胶微球和硫酸软骨素的海藻酸钙微胶珠中，之后添加神经诱导分化培养液，并在旋转式反应器中进行培养，以促进间充质干细胞向神经前体细胞体外定向分化，并实现其增殖，分化结束后，利用柠檬酸钠溶液溶解海藻酸钙微胶珠，收获分化细胞。本发明操作简单，成本低，明胶微球可为支架内部细胞提供必要的生长空间，硫酸软骨素可模拟神经组织细胞外基质的生化功能，而海藻酸钙微胶珠提供了近似细胞外基质的三维结构支撑，旋转式反应器则提供了必要的微重力环境，进一步强化传质，并实现其增殖。

技术领域

本发明涉及再生医学领域，是一种促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化、增殖的方法。

背景技术

神经前体细胞由于能够分化为神经元，因此是修复神经组织损伤的理想种子细胞。但是人源神经前体细胞来源非常困难，限制了其临床应用。研究已经表明人间充质干细胞可以分化为神经前体细胞，这为神经组织修复提供了新的途径。然而，目前诱导间充质干细胞向神经前体细胞定向分化是在二维条件下进行的。研究已经发现，二维培养条件和体内组织三维生长微环境相差巨大，二维培养的细胞逐渐丢失了其生理功能，这造成使用目前的二维诱导方法定向分化的效率低，且扩增倍数也低。因此，需要迫切发展能够模拟体内神经组织三维微环境的诱导间充质干细胞向神经前体细胞定向分化，并实现前体细胞大量增殖的新方法。

在体内神经组织中神经细胞呈三维状态生长，细胞外基质所形成的三维网络为细胞提供了必要的结构支撑和功能调控。海藻酸钠是一种海洋天然高分子多糖，无毒，生物相容性好，其与钙离子反应能够形成三维水凝胶，此凝胶结构类似神经组织细胞外基质三维网络，因此以其作为框架所构筑的三维诱导体系将最为接近体内神经组织。另外，常规100mM氯化钙条件下制备的海藻酸钙微胶珠内部径向孔道很小，因此物质传递是限制神经分化的一个重要因素，提高钙离子浓度将显著提高其和海藻酸钠分子的反应速度，将形成尺寸更大的朝向中心的径向孔道，从而显著促进因子及营养物质向支架内部传递，有助于进一步提高分化效果和支持细胞扩增。精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸(RGD)、异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸(IKVAV)及酪氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸(YIGSR)是神经组织细胞外基质蛋白的活性功能片段，对于神经分化具有显著的促进作用，使用这些多肽修饰后的三维支架将大大加强其诱导分化能力。此外，体内神经组织细胞外基质中还含有大量的硫酸软骨素，它对于神经细胞的存活以及功能发挥起到至关重要的调控作用，将其与三维支架结合在一起将能够同时从物理结构及生化特性上模拟神经组织细胞外基质。另外，细胞的运动以及增殖需要足够的空间，水凝胶的孔隙率一般只有十几微米，大大限制了分化后神经前体细胞的扩增，因此必须增加水凝胶内部的孔隙率或者空间才能实现细胞大量增殖。明胶是胶原水解的产物，具有低温形成凝胶，超过37℃左右变成溶液的特殊性质。将其在低温条件下制备成微球，之后添加到三维支架中，当放置在培养箱中时，支架内部的明胶微球随温度升高将会溶解，在支架内部形成球形空洞，这大大增加了细胞扩增所需要的空间。此外，间充质干细胞向神经前体细胞定向分化需要bFGF和EGF的支持，在体外这两种因子加到培养液中很快就失活，而在含有硫酸软骨素和明胶的体系中，因子和多糖会形成复合结构，显著延缓了因子的降解，进一步提高了因子的支持作用。神经前体细胞是以细胞球的方式生长，旋转式反应器特殊的微重力环境可以使得细胞高效成球，并进一步提高支架的传质效率，从而促进神经分化及扩增。

由以上分析可知，影响神经分化的因素很多，将海藻酸钙凝胶、钙制备条件、硫酸软骨素、明胶微球及旋转反应器有机组合起来，在bFGF和EGF的作用下才能够高效模拟体内神经组织微环境，促进间充质干细胞向神经前体细胞定向分化，并实现其大量增殖。另外，其中涉及到的一些重要参数，包括氯化钙溶液浓度、硫酸软骨素和海藻酸钠混合的质量比、硫酸软骨素分子量、RGD、IKVAV及YIGSR多肽种类和混合比例等将对神经分化及扩增效果有显著性影响。因此，如何设计新型的诱导分化体系及获得最优的参数是急需要解决的难题。

发明内容