[发明专利]一种FRAX综合症相关基因FMR1检测试剂盒及其应用

权利要求书

1. 一种FRAX综合症相关基因FMR1突变的检测试剂盒，其特征在于，包含有FRAX相关基因FMR1突变检测探针组合物：包括第一对引物容器、第二引物容器、第三对引物容器和第四引物容器；所述第一引物容器内具有第一PCR引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的干燥粉末或溶液；所述第二引物容器内具有第二PCR引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的干燥粉末或溶液；所述第三引物容器内具有第三PCR引物组SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO：6的干燥粉末或溶液，所述第四引物容器内具有第四组PCR引物SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO：6的干燥粉末或溶液。

2. 如权利要求1所述检测试剂盒在FRAX综合症相关基因FMR1突变检测中的应用，其特征在于具体步骤为；

（1）提取检测对象的基因组DNA；

（2）采用平行对照方法，取等量基因组DNA建立HpalI酶切和对照体系，即两管反应体系，HpalI酶可以切开非甲基化DNA；

（3）以经上述预处理的DNA为模板，分别建立4个PCR反应体系；把4个PCR体系扩增产物等量混合，然后进行毛细管电泳，收集数据后用GENEMAPPER软件包分析；其中，蓝色和黑色产物代表未处理DNA，反映FMR1对应区域长度或(CGG)n拷贝数；绿色和红色产物代表甲基化可抵抗HpaII的DNA；通过比较蓝色和绿色产物峰得出甲基化情况；对于绿色和红色产物，因为一侧引物处于(CGG)n区，在FMR1相应区域长度大于仪器设定量程时提供最小长度判断。

3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2）中所述采用平行对照方法，取等量基因组DNA建立HpaII酶切和对照体系即两管反应体系，其中A管仅使用HpaII酶缓冲液对照，B管使用HpaII酶切；A管DNA可以被4个引物组扩增，B管非甲基化DNA对应位点被切开，不能被扩增，而甲基化DNA保持完整可以被引物扩增；具体为：A管加入DNA模板100 ng，Hpa1I（NEB）缓冲液 1μL，Hpa II 0.2 μL，加水到10　μL， 37℃ 2Hr；80℃，20 min；B管加入DNA模板100 ng，HpaII（NEB）缓冲液 1μL，加水到10μL， 37℃ 2Hr；80℃，20 min。

4. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（3）中所述分别建立4个PCR反应体系，具体为：

第1管反应体系：

A管处理模板                  1 μL

KOD-FX酶                      1单位

2× KOD-FX 缓冲液       5 μL

2.5 mM dNTPs                 1 μL

第一对引物混合物          1 μL

加水到10 μL；

第2管反应体系：

B管处理模板                   1 μL

KOD-FX酶                      1单位

2× KOD-FX 缓冲液       5 μL

2.5 mM dNTPs                 1 μL

第二对引物混合物          1 μL

加水到10 μL；

第3管反应体系：

A管处理模板                  1 μL

KOD-FX酶                      1单位

2× KOD-FX 缓冲液       5 μL

2.5 mM dNTPs                 1 μL

第三组引物混合物          1 μL

加水到10 μL；

第4管反应体系：

B管处理模板                   1 μL

KOD-FX酶                      1单位

2× KOD-FX 缓冲液       5 μL

2.5 mM dNTPs                 1 μL

第四组引物混合物          1 μL

加水到10 μL；

反应条件：KOD-FX，98℃ 2分钟；98℃ 20秒、68℃ 4分钟共40个循环；68℃保温60分钟。