[发明专利]用于检测人UGT1A1基因多态性的引物、探针、荧光PCR试剂盒和方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医学临床分子检测领域，具体涉及用于UGT1A1基因*6型与*28型两个位点核苷酸多态性检测的引物、探针、荧光PCR试剂盒和检测方法。

背景技术

尿苷二磷酸葡萄糖醛酰转移酶（UGTs）是一大类能催化葡萄糖醛酸与亲核底物结合的膜结合酶，主要存在于肝脏和肝外组织内质网。UGT分为两个家族，已经发现有17种人类的基因编码不同序列的UGT。酶的表达具有明显的组织特异性，主要在肝脏中表达，其他组织包括脑、肾、胃肠道等。UDP-葡萄糖醛基转移酶1A1（简称UGT1A1），参与多种物质的葡萄糖醛基化，这一结合反应的目的在于增加底物的水溶性，增加从胆汁和尿液中的排泄量，达到物质代谢、解毒的目的。UGT1A1基因有30多个等位基因，其中一些SNP可影响酶的功能和分步。

伊利替康是（Irenotecan， CPT-11）是喜树碱半合成衍生物，在体内经羟酸酯酶水解成7-乙基-10-羟基喜树碱（SN-38），SN-38是DNA拓扑异构酶I的抑制剂，作用于细胞周期S期，抑制、干扰DNA修复和转录。伊利替康自用于临床后，一直是治疗直结肠癌最有效的化疗药物之一。但在临床使用中，也发现伊利替康会导致严重的血液毒性和消化道毒性，表现为腹泻和中性粒细胞减少，发生率可达30%和50%，严重时会导致死亡。

临床研究研究表明UGT1A1*6型和*28型与伊利替康引发的副反应有着强相关性，且种族差异。在高加索患者中，UGT1A1*28纯和子（TA7/7）和杂合子（TA6/7）显著增加患者发生严重粒细胞减少和腹泻的风险。而在亚洲患者中，UGT1A1*6型突变显著增加患者发生3~4级中性粒细胞减少、血小板减少及腹泻的风险。

UGT1A1*6型的多态性表现为c.211G>A。亚洲人群中，A/G和A/A携带者在伊利替康治疗中，发生3~4级中性粒细胞减少和非血液学毒性的风险显著提高，UGT1A1*6型突变在亚洲人群中的携带比例高达13~23%。UGT1A1*28多态性是指UGT1A1基因启动子区TA碱基重复序列的多态性，正常野生型为6个TA重复序列（TA6），而*28型则含7个TA重复序列（TA7），根据TA重复序列的多少，可以分为*1/*1、*1/*28和*28/*28。UGT1A1*28纯合突变型在非洲人和高加索人中频率较高达到12~27%和5~15%，在亚洲人中，仅为1.2~5%。

对UGT1A1多态性基因型进行分析，大多采用PCR-RFLP、DNA直接测序法，荧光PCR法，HRM法和毛细管电泳法。由于PCR-RFLP技术依赖限制性内切酶消化、电泳分析等原因，往往出现结果误判现象，影响其检测准确率，另外其检测周期长、通量较低，亦不适用于大量人群的快速筛选。另外，作为基因检测金标准的DNA直接测序法，由于其需要昂贵的仪器设备和复杂的操作流程以及检测周期长的特点，难以实现大规模推广。其他方法也存在特异性不高，检测周期长等缺点。

发明内容

本发明针对现有技术检测UGT1A1基因多态性时价格昂贵、周期长、低效率、数据分析繁琐等不足，提供了一种基于实时荧光定量PCR技术平台的UGT1A1基因多态性检测的引物和荧光探针、试剂盒及检测方法，用于检测人UGT1A1*6型c.221位点（G/A）多态性和*28型启动子（TA6/7）多态性，本发明快速、成本低，具有广泛推广价值。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种用于检测人UGT1A1基因多态性的检测引物及其相应探针，根据UGT1A1基因c.221位点（G/A）多态性设计，序列如下所示：

反向引物：

UGT1A1 *6G: 5’- GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACC -3’ （ SEQ ID No.1）；

UGT1A1 *6A: 5’- GTCTTCAAGGTGTAGCATGCACT-3’ （ SEQ ID No.2）；

正向引物：

UGT1A1 *6F: 5’- ACTGTTGATCGCAGTGGATGG -3’ （ SEQ ID No.3）；

荧光探针：

TM-UGT1A1*6: 5’荧光基团- CTAGCACCTGACGCCTCGTTGT -3’淬灭基团（ SEQ ID No.4）。

本发明还提供了一种用于检测UGT1A1基因多态性的检测引物及其相应探针，根据UGT1A1基因*28型（TA6/7）多态性设计，序列如下所示：

反向引物：