[发明专利]一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明涉及细胞工程技术领域，尤其涉及一种从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的方法。

背景技术

2001年，细胞生物学家通过脂肪抽吸术，在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离得到了多向分化的干细胞，并发现它能分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞；这种从人脂肪组织中发现的具有分化潜能的成体干细胞，被称为人脂肪干细胞(Human Adipose Derived Mesnchymal Stem Cells，hADSCs)。相比于其它干细胞，hADSCs具有以下五方面的显著优势：(一)来源丰富，取材容易。(二)易于扩增，不易衰老。实验证明，传代后的hADSCs成纤维细胞样生长，多次传代后细胞生长速度也无减慢趋势，即可以继续保持结构和功能上的稳定性。(三)具有旁分泌功能，可分泌促进血管生成的相关因子，促进血管再生。同时，hADSCs也可通过旁分泌作用于成纤维细胞，促进皮肤表皮细胞的成熟，以利于创面愈合和疤痕缩小。这些特性预期在美容方面具有十分可观的应用前景。(四)具有较低的免疫原性，在进行自体或者异体移植时，不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应。(五)经过多年的研究，科学家们发现hADSCs经血液系统进入人体以后，具有很好的调理全身的作用，可以显著地提高机体的灵活性及耐受性、调节机体的内分泌水平并改善神经系统对机体的支配功能，从而起到增强机体活力、改变精神面貌、延缓衰老和保持机体年轻状态的功效。也就是说，hADSCs可以有效地推动抗衰老治疗技术的发展，同时在组织工程、器官修复、基因治疗等多个医学领域也有着广阔的应用前景。

通常，人脂肪干细胞的分离和培养工艺流程如图1所示，经历了人体脂肪组织、细胞悬液、原代细胞、P1代细胞、P2代细胞以及可应用的人脂肪干细胞样品等六个阶段，涉及人脂肪干细胞的分离技术、收获技术、传代技术、冻存技术、复苏技术等关键工艺技术。其中，人脂肪干细胞的分离技术是整个人脂肪干细胞应用工艺的基础和关键步骤，很大程度地决定了最终所得人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性。特别地，如果经分离得到的人脂肪干细胞的纯度较低、含有组织微块等杂质，将不利于其进行分化诱导，从而严重地降低其抗衰老功效。

因此，人脂肪干细胞的分离技术一直都是本领域的研究热点。目前，从人脂肪组织中分离人脂肪干细胞的基本方法是：首先，对所获得的人脂肪组织样品进行洗涤，除去血细胞；然后，进行脂肪破碎、消化，去掉其它杂细胞；接着，除去未消化的组织，获得含脂肪干细胞的滤液；最后，离心得到脂肪干细胞群，可用于后续的培养、传代以及冻存等。该基本方法所面临的技术难题包括：方法步骤复杂、制备过程难以进行质量控制、提取的干细胞数量少、样品纯度不高以及继代增殖缓慢等。多年以来，研究人员一直对现有技术进行改进和优化，以求开发出一种更加经济有效的人脂肪干细胞分离技术，从而为人脂肪干细胞的研究提供充足的高质量样品。其中，中国专利CN201210018269.3公开了一种脂肪干细胞的获取方法，该方法采用混合胶原酶(即I型胶原酶、II型胶原酶与IV型胶原酶的混合物)对脂肪组织进行消化，从而克服了传统的细胞分离方法中存在的胶原酶消化细胞不够彻底、所得细胞纯度不够高的问题。中国专利CN201210181162.0公开了一种人体脂肪干细胞快速提取方法，该方法使用了专用的人脂肪组织消化剂，其成分包含胶原酶IV型、胰蛋白酶-EDT复合体、抗胰蛋白酶和二甲基亚砜，从而可以使脂肪间充质干细胞充分游离出来同时保护细胞不受伤害，最终获得充分游离且存活率高的人脂肪干细胞。中国专利CN201110154507.9公开了一种脂肪干细胞的分离方法，该方法主要包括四个步骤：(1)用洗涤液行洗涤；(2)用胶原酶进行消化；(3)进行过滤，获得含脂肪干细胞的滤液；(4)进行离心，所得沉淀即为脂肪干细胞群。上述前两种方法，因应用了混合胶原酶或者专门的消化剂，将不可避免地增加了人脂肪干细胞分离工艺的技术难度和经济成本。而第三种方法，其洗涤脂肪组织的步骤过于简单，样品中的血细胞等杂质难以完全清除干净，不利于人脂肪干细胞的分化诱导，影响人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性。

发明内容

本发明针对现有的人脂肪干细胞分离技术存在分离不干净、纯度低从而影响人脂肪干细胞的分化诱导，导致人脂肪干细胞产品的收率、纯度和活性低的问题，通过优化清洗人脂肪组织步骤和胶原酶硝化步骤而提供一种从人脂肪组织中有效分离人脂肪干细胞方法，使传代细胞生长状态好，人脂肪干细胞得率高，工艺成本低。