[发明专利]一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及扫描电镜观察材料制备领域，尤其是指一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法。

背景技术

藓类植物微形态学特征常常是分类的重要依据，如蒴齿表面疣的有无、疣的分布形式、疣的形态，孢子表面纹饰，叶细胞表面疣的有无、疣的数目、形态，芽胞结构、假根上疣的有无以及叶中肋上丝体或栉片等特殊附属结构，这些特征在分类群（如科、属、种）间区分度明显，且在分类群内稳定。由于形态微小，扫描电镜就成为重要的观察工具。扫描电镜观察生物样品必须经过干燥和导电处理，在这一过程中存在样品缩水问题。对于藓类植物的蒴齿结构及孢子等观察样品的处理相对简单，因为这些结构细胞壁厚，表面较为坚硬，自然风干即可。但对于叶、假根和芽胞等含水量较高的幼嫩器官自然风干后，细胞易出现收缩、塌陷等变形，致使这些重要结构严重失真。藓类植物细胞有细胞壁不同于动物组织的处理方法。样品形态微小，叶由单层细胞组成，假根由单列细胞组成，所以也区别于其他高等植物组织的处理方法。

中国发明专利（申请号：201410251628.9，公开号CN 104020030A）披露了一种扫描电镜用的昆虫样品的制备方法，其包括昆虫材料清洗、组织固定、脱水、置换、干燥、喷金等步骤，并且组织固定是将昆虫材料浸于固定液中并于微波炉中加热一段时间，再分别于室温和低温下各固定一段时间。以上方法可获得更为清晰的昆虫表面结构的扫描电镜图像，能更好地保持整体昆虫形态结构，不易发生变形、皱缩及塌陷。以上专利文献虽然提供了一种针对于制备动物扫描电镜观察材料的可行性方案，然而，由于动物细胞没有细胞壁，因而将其转用到制备植物电镜观察材料基本无法实现，而国内要制备一种能够较为理想地保留样品微细结构的植物电镜观察材料较为少见，特别是制备藓类样品，国内相关技术仍处于空白。

发明内容

本发明提供一种藓类植物扫描电镜观察材料及其制备方法，其主要目的在于克服现有在制备藓类植物电镜观察材料过程中存在的细胞易出现收缩、塌陷等变形，致使样品微细结构严重失真的缺陷。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法，包括以下步骤：a、分拣：由生物结皮中分拣藓类植株材料，清洗后，从该藓类植株材料上剥离复数片带丝体的叶片；b、固定：将步骤a中获得的叶片置于戊二醛溶液中固定，固定温度为0～10摄氏度，固定时间为1～5小时，固定后用缓冲液冲洗；c、脱水：使用梯度浓度酒精逐级脱水；d、置换：将脱水后的叶片置于乙醇-乙酸异戊酯混合液中置换，之后再置于乙酸异戊酯溶液中置换；e、临界点干燥；f：装台。

进一步的，步骤a中的所述藓类植株材料为流苏藓植株材料。

进一步的，步骤b中戊二醛溶液的浓度为2%～3%，固定条件为：在4摄氏度下固定3h。

进一步的，步骤b中戊二醛溶液的浓度为2.5%，并且通过0.2M·L-1的磷酸缓冲液配制而成。

进一步的，步骤b中包括固定后用pH=7.2的0.1 M·L-1磷酸缓冲液冲洗3次，每次5 min。

进一步的，步骤c的逐级脱水包括使用50%、70%、80%、90%浓度的酒精各脱水5min，之后使用100%、100%、100%浓度的酒精分别脱水5min、10min、20min。

进一步的，步骤d中所述乙醇-乙酸异戊溶液中乙醇和乙酸异戊溶液的体积比例为1：1，置换时间为15min，步骤d中所述乙酸异戊溶液的置换时间为两次且每次置换20min或者为过夜置换。 

进一步的，步骤e包括将步骤d获得的叶片移入内面铺有滤纸的钢网篮中，用临界点干燥仪液化CO₂干燥2 h。

进一步的，步骤f包括将步骤e获得的叶片移到贴有双面胶带的金属台上，经离子溅射仪喷金。

一种采用上述一种藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制备而成的藓类植物扫描电镜观察材料。

和现有技术相比，本发明产生的有益效果在于:

本发明制备藓类植物扫描电镜观察材料的方法简单易行、效果甚加，一方面通过选用戊二醛作固定液，对多糖、糖蛋白、微管等有较好的固定作用，并不会使组织细胞固定后变脆；另一方面通过采用临界点干燥法可避免叶片细胞表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。因而可以为制备较为理想的藓类样品提供借鉴，填补国内相关领域的技术空白。

附图说明

图1为经本发明中藓类植物扫描电镜观察材料的制备方法制得的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。

图2为常规的厚肋流苏藓叶片上丝体样品照片。