[发明专利]浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地说，涉及浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法。

背景技术

DNA条形码(DNA-barcoding)是目前最有力的物种鉴定技术之一，尤其在未知物种的鉴定中起着重要的作用。随着二代测序通量的提高和测序成本的降低，DNA条形码技术开始越来越多的应用在环境生物多样性的调查中。目前基于DNA条形码的物种鉴定都要依托PCR的放大过程，首先扩增能够区分物种的DNA片段，然后根据序列差异鉴定物种。目前用于鉴定动物的DNA条形码主要是线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因片段，经检索，中国专利申请号CN 102827839A，申请日为2012年9月4日的发明专利公开了一种鸟蛤贝类线粒体COI基因扩增引物，该发明利用通用引物扩增得到的66条鸟蛤科mtCOI序列，通过CLUSTALW软件比对分析，在确定的保守区域用引物设计软件Primer Premier 5设计5对引物，用216个鸟蛤科个体在10μL体系下重复进行PCR反应试验，最后经琼脂糖凝胶电泳检测，筛选出一种鸟蛤科贝类线粒体COI基因序列高效扩增引物，即为NGF5’-ACAAATCATAAAGATATTGG-3’和NGR5’-TTCAGGGTGTCCGAAGAATCA-3’，该发明的鸟蛤科贝类线粒体COI引物可有效地扩增出鸟蛤科贝类不同物种的目的片段，能够满足鸟蛤遗传多样性研究的需要。中国专利申请号CN 101942433A，申请日为2010年8月12日的发明专利公开了一种骨螺科线粒体COI基因扩增引物的筛选方法，其步骤为：a、用COI通用扩增引物扩增出部分骨螺科物种的COI序列，b、将所述的COI通用扩增引物序列与已获得的部分骨螺科物种的COI序列进行比对，找出骨螺科线粒体COI序列在COI通用扩增引物序列段的所有突变碱基，重新合成不同的骨螺科COI扩增引物，c、从新合成的不同COI扩增引物中筛选出扩增骨螺科物种效果最好的一对引物，采用该发明的骨螺科线粒体COI基因扩增引物，可以有效的扩增出骨螺科不同物种的COI序列，对于利用COI序列研究骨螺科的物种分类、系统发育、系统地理学和保护骨螺科种质资源具有重要意义。

虽然COI基因能够很好区别不同的动物，但对于甲壳动物类群有较低的扩增能力，而且通用的COI引物简并度过高，PCR反应对DNA聚合酶的要求苛刻；而且传统的COI引物扩增的片段大小是658bp，难以在高通量测序平台上进行测序，这也限制了其在环境物种多样性分析中的应用。因此需要研究一种引物，能在高通量测序平台上进行测序，适用于物种鉴定、生物多样性分析等研究。

发明内容

1.要解决的问题

针对现有COI引物存在简并度过高，PCR反应条件苛刻、对甲壳动物类群扩增能力差以及难以在高通量测序平台上进行测序等问题，本发明提供一种浮游动物rrnL基因扩增引物及其筛选方法和应用及应用方法，线粒体核糖体基因rrnL是动物线粒体基因组中相对比较保守的基因，是潜在的进行物种鉴定的条形码之一，本发明依据后生浮游动物类群的rrnL基因序列设计了5条上游引物和4条下游引物，上下游引物的组合可以扩增出长度190bp到390bp不等的PCR产物，引物的简并度低，PCR成功率高，而且PCR产物的长度可以兼容二代高通量测序平台，可用于物种鉴定、生物多样性分析等研究。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

浮游动物rrnL基因扩增引物，包括5条上游引物和4条下游引物，所述的5条上游引物分别为ZoorrnL_80F1：GACTGTGCTAAGGTAGCATAAT、ZoorrnL_80F2：GACTGTGCTAAG GTAGCGTGAT、ZoorrnL_200F1：GACGATAAGACCCTATGAAGCT、ZoorrnL_200F2：GACG ATCAGACCCTTTGGAGCT、ZoorrnL_200F3：GACGAGAAGACCCCATAAAACT；所述的4条下游引物序列分别为ZoorrnL_320R1：GCTGTTATCCCTAGGGTAACTT、ZoorrnL_320R2：CCTGTTATCCCCAAAGTAGCTT、ZoorrnL_400R1：TAATCCAACATCGAGGTCGCA、ZoorrnL_400R2：TAATCCAACATCGAGGT AGTA。

上述的浮游动物rrnL基因扩增引物的筛选方法，其步骤为：

(a)从NCBI数据库和BLOD数据库中获取所有浮游动物的rrnL基因序列，将其分为轮虫组、枝角组和桡足组；