[发明专利]一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及的是一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因及含有该基因的载体和重组菌株，以及利用重组菌株制备卵形鲳鲹硫氧还蛋白。

背景技术

硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)又称白细胞介素-1样细胞因子，是生物体内普遍存在的小分子还原蛋白，分子量在12kD左右，具有共同的特征：①所有Trx中均有一个外露的又两个Cys残基组成、高度保守的活性中心(CXXC)；②二级结构包括4个α螺旋和5个β折叠，β折叠被α螺旋包围构成紧密球形；③活性中心位于α螺旋起始端和β折叠尾部之间；④氧化态Trx活性中心有一个由Cys残基组成的二硫键(S-S)。Trx最开始是作为大肠杆菌(Escherichia coli)核糖核酸还原酶的电子供体。此后，由于发现其发挥多种中药生物学功能而受到人们重视，发现其广泛存在于原核生物和真核生物体内。植物的细胞质、叶绿素、线粒体和细胞核中都含有Trx。根据表达部位的不同，可把硫氧还蛋白为3类：(1)Trx1，主要存在于细胞质，在细胞核及胞外也有发现。Prx1缺少信号肽，但是以一种类似白介素1β的分泌方式释放胞外；(2)Trx2，N-端具有线粒体引导序列，是一种线粒体特异性蛋白，具有Trx保守型酶催化位点，缺少保守型的结构Cys残基，在清除活性氧(ROS)及线粒体凋亡信号通路调节中起重要作用；(3)Sptrx，是Trx家族中睾丸/精子细胞特异性表达的蛋白，无氧化还原酶活性；

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)隶属脊索动物门(Chordata)，硬骨鱼纲(Osteichthyes)，鲈形目(Perciformes)，鲈亚目(Percoidei)，鲹科(Carangidae)，为名贵食用鱼类，在我国南方海域已有相当的人工养殖规模。然而，近年来卵形鲳鲹病害频发，引起了较高的死亡率，成为制约卵形鲳鲹养殖产业可持续发展的技术瓶颈之一。目前还未有人进行卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因方面的研究。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA和由此推断的氨基酸序列。

本发明的第二个目的在于提供含上述卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的表达载体和利用该载体转化的重组微生物。

本发明的第三个目的在于提供一种从所述的微生物制备重组卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的过程。

本发明的第一个目的是通过如下技术方案来实现的：一种卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明中的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因，其氨基酸序列如SEQ ID：2所示。

本发明的硫氧还蛋白全长基因是以转录组测序得到卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因部分序列，以卵形鲳鲹肝脏总RNA反转录得到的cDNA为模板，然后经Smart-RACE方法扩增得到末端序列，最后经序列拼接获得卵形鲳鲹硫氧还蛋白cDNA基因全长序列。

本发明用于表达卵形鲳鲹硫氧还蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列是以卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因双链DNA为模板，经PCR方法扩增而得到的，它来源于卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的成熟肽区域所对应的基因片段。

按照上述的卵形鲳鲹硫氧还蛋白重组蛋白的成熟肽基因序列，它正好是卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因117 bp至440 bp(相当于第39至第147位氨基酸)的片段，其核苷酸序列及其所编码的氨基酸序列如下所示。

卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA，它的核苷酸序列如下所示：

其中底部下划线部分为卵形鲳鲹硫氧还蛋白的成熟肽的DNA序列。

卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的氨基酸序列如下所示：

卵形鲳鲹硫氧还蛋白的成熟肽的氨基酸序列

本发明的氨基酸序列分析表明卵形鲳鲹硫氧还蛋白由107个氨基酸参加组成，无信号肽序列，107个氨基酸序列为成熟肽序列。

本发明的第二个目的是通过如下技术方案来实现的：一种表达载体，其为含有上述卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的cDNA的表达载体；以及利用上述载体转化的重组微生物。

本发明所述的表达载体的构建方法是按常规方法，将通过PCR方法合成的卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因经酶切和分离纯化后，连接到已有的相应载体的相应酶切位点(即BamH Ⅰ和EcoRI)之间，即构建成所需的含有卵形鲳鲹硫氧还蛋白基因的表达载体。