[发明专利]一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种纳米微泡的制备方法，具体涉及一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，属于生物医学工程领域。

背景技术

肝癌是威胁人类健康的一大杀手，被称为“癌中之王”。发病率呈逐年上升趋势，据统计，每年全球肝癌发病率位居恶性肿瘤发病率的第五位，死亡率位居第三位，新患肝癌患者中55％发生在中国。手术切除是其治疗的主要方法。然而，肝癌细胞生长迅速较早发生血液转移，因此大多数患者失去了手术的机会。传统的放、化疗对其治疗效果也并不理想。肝脏因其再生能力强、合成多种蛋白质等特点，已成为基因治疗的理想靶器官。

以往研究显示，NET-1基因属于四次跨膜蛋白(TM4S)家族成员，在细胞信号转导、调节、黏附、移动、增殖和分化中起重要作用，具有显著上调癌形成的作用。RNA干扰技术，是指由与靶基因序列同源的短的双链RNA(siRNA)引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。siRNA是一种小RNA分子(21～25核苷酸)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。双链RNA经酶切后会形成很多小片段，称为siRNA。siRNA只降解与其序列互补配对的mRNA。其调控的机制是通过互补配对而沉默相应靶位基因的表达，所以是一种典型的负调控机制。

超声微泡既可以作为超声显像的造影剂，又可以作为药物或基因的载体，实现药物和基因的靶向递送，是一种无创性、具有组织和器官特异性的药物运载工具。超声靶向照射特定区域内的微泡，可使之破坏、爆破，释放其携带的药物或基因，使局部药物或基因含量增多。

肿瘤血管由两部分组成，一部分是宿主固有的血管，在肿瘤生长的过程中，宿主局部的微血管大部分被破坏，仅有动脉和较大的静脉可能保留下来，成为肿瘤血管系统的主干，该部分血管通透性正常，其管壁的最大孔径不超过100nm；另一部分是肿瘤新生血管，其结构不完善，基底膜不完整，管壁薄且缺乏平滑肌层，通透性明显升高，其管壁的最大孔径约380～780nm，有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连。纳米级微泡可以有效的通过孔径约380～780nm的血管壁进入肿瘤组织内部，更加高效的转运NET-1siRNA。

本发明拟导入NET-1siRNA，沉默NET-1的表达，从根本上抑制肝癌细胞的增长，起到治疗肝癌的作用。以何种方式导入NET-1siRNA是其能否高效发挥作用的首要前提，也是肝癌基因治疗的核心问题。本发明发明人前期研究发现低频超声联合微泡转染NET-1siRNA能够有效抑制肝癌细胞的生长，但基因转染效率有限。据此提出假设，应用超声联合靶向载NET-1siRNA纳米微泡治疗肝癌，将G-PLL作为靶向配体制备靶向纳米微泡，并将NET-1siRNA与其偶联，构成仅有纳米级大小的载基因复合物。该复合物在超声波的照射下经过血管壁进入肿瘤细胞内，有效地解决siRNA在体内易降解、难以进入靶细胞这一难题。

本发明发明人设想构建纳米级微泡造影剂作为NET-1siRNA的载体，这样既可以使治疗基因穿过血管内皮间隙进入肿瘤组织内部，同时在超声波的辐照下，利用空化效应和声孔效应进一步提高肿瘤组织局部基因含量，提高基因转染效率，保护siRNA免受血液循环中核酸酶的降解，提高治疗效果，此外这种纳米微泡还可以进行成像，使得纳米微泡既可以作为治疗基因的载体又可以作为超声成像的造影剂，具有双重作用。

但一般纳米微泡对肿瘤组织的特异性较差，不能保证靶部位较高的siRNA浓度，提高基因治疗的靶向性。目前，关于靶向造影剂的制备方法包括两种，一种是通过靶向配体与载体的静电吸附能力制备。另一种是以偶联“生物素(Biotin)-亲和素(Avidin)”的方法制备。该纳米微泡表面通过氨基聚乙二醇偶联生物素，再与亲和素修饰的生物素化靶向分子特异性结合，构成靶向纳米微泡。本发明利用半乳糖基化多聚赖氨酸(G-PLL)能与肝癌细胞的ASGP-R特异性结合的特性，制备肝癌细胞特异靶向性纳米微泡。

发明内容

本发明的目的在于提供一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法以及由该制备方法制备得到的携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

一种携NET-1siRNA的双功能肝癌靶向纳米微泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：