[发明专利]获取无菌微囊藻纯种的方法

权利要求书

1.获取无菌微囊藻纯种的方法，其特征在于,首先打散微囊藻与细菌之间的粘附，其次通过流式细胞仪分选技术，以及分部收集，可以获得微囊藻的无菌培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用如下步骤进行蓝藻的纯化：

（1）调节微囊藻培养液浓度

（2）超声处理培养液

（3）采用流式细胞仪对微囊藻进行2次以上分选，初步获得微囊藻的纯培养

（4）进一步采用分部收集或者划线法纯化，从而获得无菌微囊藻。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述细胞浓度为10⁴-10⁵个/ml。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述的超声处理条件为: 超声波频率20-45 kHz，功率为30 W，工作3s-5s，共三次。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（3）在流式细胞仪中进行。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

①低功率超声波打散：破坏微囊藻与污染细菌之间的粘附，采用低功率30 W的超声波方法，达到不破坏藻细胞，但是将聚集的细胞分散开；

工作3 s，间歇3s，打散，镜检；

②流式细胞仪的灭菌处理：首先用70%乙醇冲洗除去流式细胞仪管道中的细菌，然后采用PBS冲洗半小时，并作为分选鞘液；

其次，开紫外照射工作台，以达到无菌工作状态；

③流式分选：通过侧向散射光（SSC，依据BD公司2.49um的nile小球，圈定约3um的区域），并通过荧光3 通道（FL3,激发波长为488nm，叶绿素a 荧光），将待处理的微囊藻培养液以低速率200-300个细胞/秒进样；

根据所圈定的范围，收集微囊藻细胞，采用无菌BG11培养基进行收集，作为初次分选微囊藻；

④将第一次分选液作为待分选的培养液，按照同样的设置进行，收集为二次分选液，以此类推，一般获得三次分选培养液，可将绝大部分细菌去除；

⑤将第三次分选液通过分部收集或者在BG11固体培养基上划线培养，可以获得无菌微囊藻；

其中分部收集可立即获得微量的无菌微囊藻；划线培养一般需要一个月的时间能获得微囊藻无菌藻落，然后再转接无菌BG11液体培养基培养。